生脈飲、失笑散對阿霉素心臟毒性心衰模型大鼠脂質(zhì)過氧化影響的對比研究

楊麗祥彭 哲

生脈飲、失笑散對阿霉素心臟毒性心衰模型大鼠脂質(zhì)過氧化影響的對比研究

楊麗祥1彭 哲2

目的 觀察生脈飲、失笑散對阿霉素心臟毒性心衰模型大鼠脂質(zhì)過氧化的影響。方法 SD大鼠108只分為正常組、模型組、曲美他嗪組、生脈飲高劑量組、生脈飲低劑量組、失笑散組，每組18只。阿霉素腹腔注射制備心臟毒性心衰模型，各藥物組予相應(yīng)藥物灌胃（曲美他嗪組、生脈飲低劑量組、失笑散組均為臨床等效劑量，生脈飲高劑量組為臨床等效劑量4倍），1天1次；正常組予等量生理鹽水。灌胃14天后及28天后分別采集標本。酶聯(lián)免疫法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。結(jié)果 ①灌胃28天，模型組SOD（1.992±0.245）ng/mL，與其余各組比較明顯下降（P＜0.05）；生脈飲低劑量組SOD（4.142±0.362）ng/mL高于失笑散組的（3.643±0.366）ng/mL（P＜0.05）；生脈飲高劑量組SOD（5.475±0.155）ng/mL，高于低劑量組（P＜0.05）；②灌胃28天，模型組MDA（4.345±0.170）nmol/mL，與其余各組比較明顯升高（P＜0.05）；生脈飲低劑量組與失笑散組比較無明顯差異（P＞0.05）；生脈飲高劑量組MDA（2.929±0.206）nmol/mL，低于低劑量組的（3.122±0.144）nmol/mL（P＜0.05）；③各藥物組灌胃28天均較灌胃14天SOD提高、MDA明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論

大鼠；心衰模型；生脈飲；失笑散；脂質(zhì)過氧化；SOD；MDA

諸多證據(jù)表明，心臟的能量代謝障礙是心肌細胞發(fā)生損傷的始動環(huán)節(jié)，也是引發(fā)心功能惡化的重要因素。van Bilsen等[1]提出“代謝重構(gòu)”的概念，即由于心肌細胞糖類和脂肪等物質(zhì)代謝紊亂，引起能量代謝途徑發(fā)生改變從而致心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。目前優(yōu)化心肌能量代謝障礙多從氧化應(yīng)激損傷、繼發(fā)線粒體損傷、鈣超載、脂質(zhì)過氧化物酶體增殖激活受體及細胞凋亡等方面研究。本實驗研究中醫(yī)經(jīng)典方劑對抗氧化應(yīng)激損傷的作用機理。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康雄性SD大鼠108只，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供及飼養(yǎng)，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016。將大鼠分為6只/籠，實驗期間均給予標準飼料及自由飲水。

1.2 藥 物 生脈飲組方：人參10g，麥冬15g，五味子6g；失笑散組方：炒蒲黃、五靈脂各15g。各組方加水煎煮2次，第1次1.5h，第2次0.5h，2次藥液混合后濃縮成1g/mL的生藥煎劑。中藥由杭州市中醫(yī)院制劑室提供。曲美他嗪片（規(guī)格20mg/片，批號20100324，施維雅制藥有限公司）。注射用鹽酸多柔比星粉針劑（規(guī)格10mg/瓶，批號20110118，浙江海正藥業(yè)有限公司）

1.3 試劑與儀器 大鼠超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號RT201104302），大鼠丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號RT201202227）；4℃冷凍高速離心機；超低溫冰箱；-20℃低溫冰箱；Thermo labsystems公司移液槍；Thermo公司酶標儀；FA1104電子天平；自動三蒸純水蒸餾器。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥 108只SD清潔級大鼠隨機分為正常組、模型組、曲美他嗪組、生脈飲高劑量組、生脈飲低劑量組、失笑散組，每組18只。給藥劑量根據(jù)成人與大鼠等效劑量換算公式計算[2]，曲美他嗪組以臨床等效劑量為用藥量即：7.0g/（kg·d）；生脈飲低劑量組、失笑散組均予成人等效劑量即：3.6g/（kg·d）、3.5g/（kg·d）；生脈飲高劑量組為臨床等效劑量給藥量的4倍即：14.4g/（kg·d）。

公式：大鼠用量（g/kg/d）=成人臨床有效劑量（g/ d）/體質(zhì)量（kg）×換算標準（7）。注：成人平均體質(zhì)量按60kg計算。

2.2 模型建立 參照阿霉素慢性心衰模型造模方法[2]并加以改進。動物飼養(yǎng)1周，將阿霉素用注射用水溶解，配制成2mg/mL溶液，按照2.5mg/kg給藥，每周1次，共6周，累積量達15mg/kg；正常組每日腹腔注射等量生理鹽水，時程同模型建立方法。模型建立成功后，各藥物組予相應(yīng)藥物灌胃1天1次；正常組灌胃予等量0.9%生理鹽水。灌胃14天后，各組處死一半數(shù)量大鼠取材，剩余大鼠繼續(xù)給藥，28天后將剩余大鼠取材檢測。

2.3 標本采集和制備 灌胃14天后，末次灌胃禁食不禁水12h，各組隨機處死6只大鼠，采用腹主動脈取血方式抽取3.0mL，將血液置于Eppendorf管中，分離血清（4000r/min，4℃，離心15min），吸取血清存于-20℃冰箱備用；余下各組大鼠繼續(xù)灌胃治療，給足28天后標本留取方法同上。

2.4 指標檢測 按照SOD與MDA試劑盒操作說明書進行測定，用分光光度計于波長450nm測量各孔的吸光度（OD值）空白孔調(diào)零，運用CurveExpert 1.4分析軟件，根據(jù)標準品濃度及對應(yīng)的OD值計算標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠死亡率統(tǒng)計 正常組大鼠一般狀態(tài)正常，體質(zhì)量呈良性增長，存活率100%。模型組第4周死亡2只，至實驗結(jié)束共死亡6只，死亡率為33.3%；曲美他嗪組第4周死亡1只，實驗結(jié)束時共死亡4只，死亡率為22.2%。生脈飲高劑量組第5周死亡2只，至實驗結(jié)束共死亡4只，死亡率為22.2%；生脈飲低劑量組實驗結(jié)束共死亡5只，死亡率27.8%；失笑散組實驗結(jié)束死亡5只，死亡率為27.8%。

3.2 藥物干預(yù)對大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）的影響 各組灌胃14天、28天，與正常組比較，SOD水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物干預(yù)組SOD水平明顯升高（P＜0.05），生脈飲高劑量組SOD升高優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），生脈飲低劑量組SOD升高優(yōu)于失笑散組（P＜0.05）。灌胃14天，曲美他嗪組提升SOD水平作用優(yōu)于中藥干預(yù)組（P＜0.05）；灌胃28天，曲美他嗪組與生脈飲高劑量組SOD水平比較無明顯差異（P＞0.05）。正常組灌胃28天與灌胃14天SOD水平比較，無明顯差異（P＞0.05）；模型組SOD顯著降低（P＜0.05）；各藥物干預(yù)組灌胃28天SOD水平均優(yōu)于灌胃14天（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清超氧化物歧化酶比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠血清超氧化物歧化酶比較（ng/mL，±s）

注：與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，■P＜0.05；與曲美他嗪組比較，◆P＜0.05；與灌胃14天比較，*P＜0.05；與生脈飲低劑量組比較，○P＜0.05；與失笑散組比較，△P＜0.05

正常組模型組曲美他嗪組生脈飲高劑量組生脈飲低劑量組失笑散組6 6 6 6 6 6 6.313±0.791 2.421±0.403★5.167±0.489★■4.439±0.416★■◆○△3.748±0.380★■◆△3.081±0.329★■◆○6.766±0.579 1.992±0.245★* 5.871±0.294★■* 5.475±0.155★■*○△4.142±0.362★■◆*△3.643±0.366★■◆*○

3.3 藥物干預(yù)對大鼠血清丙二醛（MDA）的影響

各組灌胃14天、28天，與正常組比較，MDA水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組MDA水平明顯降低（P＜0.05）；曲美他嗪組MDA水平低于各中藥組（P＜0.05）；生脈飲高劑量組降低MDA優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）；灌胃14天，生脈飲低劑量組優(yōu)于失笑散組（P＜0.05）。灌胃28天與14天比較，正常組無明顯差異（P＞0.05），模型組MDA水平升高（P＜0.05），各藥物干預(yù)組均可明顯降低MDA水平（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清丙二醛比較（nmol/mL，±s）

表2 各組大鼠血清丙二醛比較（nmol/mL，±s）

注：與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，■P＜0.05；與曲美他嗪組比較，◆P＜0.05；與灌胃14天比較，*P＜0.05；與生脈飲低劑量組比較，○P＜0.05；與失笑散組比較，△P＜0.05

正常組模型組曲美他嗪組生脈飲高劑量組生脈飲低劑量組失笑散組6 6 6 6 6 6 1.957±0.088 4.034±0.216★2.982±0.098★■3.156±0.883★■◆○△3.300±0.078★■◆△3.476±0.068★■◆○1.944±0.072 4.345±0.170★* 2.719±0.137★■* 2.929±0.206★■◆*○△3.122±0.144★■◆* 3.278±0.113★■◆*

3 討論

正常情況下[3]，細胞中存在抗氧化物如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，均有滅活并清除氧自由基作用，其中SOD是抗氧化防御體系中能有效清除氧自由基的金屬酶類，其活性高低能反映機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，其含量可間接反映細胞受氧自由基損害的嚴重程度[4]。因此，SOD與MDA的高低與阿霉素心臟毒性的脂質(zhì)過氧化損傷程度有密切關(guān)聯(lián)[5]。阿霉素心臟毒性所致心衰，可歸屬于中醫(yī)“心悸”、“怔忡”、“喘證”等病證范疇，中醫(yī)辨證認為其病機虛、瘀所致為多。慢性心衰患者多表現(xiàn)氣短乏力，胸悶憋氣，心悸怔忡，動則氣喘，口干舌燥，自汗盜汗，口唇紫紺，舌黯紅少苔，有瘀斑，脈細澀，或促、結(jié)、代等，為氣陰兩虛夾瘀之證。治以益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)法，臨床有較好的療效。

本實驗所選方劑生脈飲，由人參、麥冬、五味子組成，人參補肺氣生津液為君；麥冬養(yǎng)陰清肺生津為臣；五味子斂肺止汗為佐。三藥合用，共奏養(yǎng)陰生津、復(fù)脈固脫之功效。研究[6]表明，生脈飲可益氣養(yǎng)陰，增強心肌收縮力，參與自由基代謝的調(diào)節(jié)，具有較強清除氧自由基抗氧化作用。張永全等[7]發(fā)現(xiàn)生脈注射液可提高患者血中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）含量。曲紹春等[8]發(fā)現(xiàn)，人參Rb組皂苷（G-Rb）通過提高SOD及GSH-Px活性，降低血清脂質(zhì)體（LPO）含量，說明其可增強抗氧化酶活性，還可以通過某種機制使脂質(zhì)過氧化過程受到抑制。

失笑散源于《和劑局方》，由五靈脂、蒲黃二味配伍組成。研究[9]表明，五靈脂煎劑在體外測定有抑制超氧陰離子自由基的作用，體內(nèi)實驗表明具有激活體內(nèi)SOD活力的作用?！侗静菥V目》謂：“蒲黃手足厥陰血分藥也，故能治血止痛，生則能行，熟則能止，與五靈脂同用，能治一切心腹諸痛”。研究[10]顯示，蒲黃可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗脂質(zhì)過氧化途徑發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，可顯著降低MDA。陳亞鑫等[11]發(fā)現(xiàn)，加味失笑散可通過提高SOD的活性，保護抗氧化酶活力，抑制了氧自由基介導(dǎo)的心肌細胞膜損害，阻止細胞內(nèi)外離子分布異常，穩(wěn)定了心肌細胞內(nèi)環(huán)境和心肌生理特性。

本研究中，大鼠連續(xù)注射阿霉素6周后，SOD水平顯著降低，而MDA水平明顯升高，提示阿霉素破壞了機體內(nèi)促氧化物與抗氧化物的平衡，抗氧化酶水平的降低增加了大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激損傷，結(jié)果與文獻報道相符合[12]。研究結(jié)果提示，生脈飲、失笑散均能通過提高心衰模型大鼠血清SOD活性、降低MDA含量，降低阿霉素心臟毒性心衰模型大鼠的脂質(zhì)過氧化損傷。益氣養(yǎng)陰的生脈飲作用優(yōu)于活血化瘀的失笑散，生脈飲高劑量組優(yōu)于生脈飲低劑量組（P＜0.05），存在一定的量效關(guān)系，且隨給藥時間延長作用更佳。該實驗存在一定局限性，從模型考慮，本實驗?zāi)Ｐ鸵孕募p害為主，而非冠脈結(jié)扎造成的心梗所致的心衰模型，因此顯示活血化瘀的中藥弱于益氣養(yǎng)陰的中藥。

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（收稿：2015-03-07 修回：2015-04-01）

Comparison of the Effect of Shengmaiyin and Shixiaosan on Lipid Peroxidation in Rats w ith Heart FailureInduced by Adriamycin

YANG Lixiang1,PENG Zhe2. 1 Department of Internal Medicine,TCM Hospital of Fuyang District,Hangzhou,Hangzhou(310000),China;2 Department of Cardiovascular Diseases,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of Shengmaiyin and Shixiaosan on lipid peroxidation in adriamycin-inducing heart failure rat model.M ethods One hundred and eight SD rats were random ly divided into blank control group,model group,trimetazidine group,low-and high-dose of Shengmaiyin groups,and Shixiaosan group,with 18 rats in each group.Heart failure model of rats was induced by peritoneal injection of adriamycin. Every group was given the corresponding drug once per day（trimetazidine,low dose of Shengmaiyin,and Shixiaosan were therapeutic dose and high-dose of Shengmaiyin was 4 times of therapeutic dose）;blank control group was given equivalent volume of normal saline.On day 14 and 28 of treatment rats in each group were sacrificed for blood sampling.ELISA was used to detect serum superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）.Results On day 28 of treatment,the serum SOD in model group（1.992±0.245ng/mL）was significantly lower than that in other groups（P＜0.05）;that in low-dose of Shengmaiyin group was higher than that in Shixiaosan group（4.142± 0.362ng/mL vs 3.643±0.366ng/mL,P＜0.05）;that in high-dose of Shengmaiyin group（5.475±0.155ng/mL）was higher than that in low dose group.On day 28 of treatment,the serum MDA in model group（4.345±0.170nmol/mL）was increased compared with that in other groups（P＜0.05）;no significant difference in that was found between lowdose of Shengmaiyin group and Shixiaosan group;but that in high-dose of Shengmaiyin group was lower than that in low dose group（2.929±0.206nmol/mL vs 3.122±0.144nmol/mL,P＜0.05）.The serum SOD was increased and MDAwas decreased on day 28 compared with those on day 14 in all groups（all P＜0.05）.Conclusion Both of Shengmaiyin and Shixiaosan treatment can reduce lipid peroxidation by elevating serum SOD and decreasing MDA in adriamycin-inducing heart failure rats.Shengmaiyin may have better efficacy than Shixiaosan does.

rats;heart failure model;Shengmaiyin;Shixiaosan;lipid peroxidation;SOD;MDA

杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（No.2011A052）

1杭州市富陽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科（杭州 310000）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院心血管科（杭州 310007）

彭哲，Tel：13157173185

生脈飲、失笑散均能通過提高心衰模型大鼠血清SOD活性、降低MDA含量，降低阿霉素心臟毒性心衰模型大鼠的脂質(zhì)過氧化損傷。生脈飲作用優(yōu)于失笑散。