高濃度葡萄糖對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響

夏佳佳王 嵐章燕珍

高濃度葡萄糖對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響

夏佳佳1王 嵐2章燕珍1

目的 觀察高濃度葡萄糖刺激下牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的增殖能力和成骨分化能力。方法 組織塊法體外培養(yǎng)非糖尿病患者PDLSCs，分別用0mg/L（正常對(duì)照組）、1100mg/L（低糖組）、4500mg/L（高糖組）濃度葡萄糖刺激，MTT法檢測(cè)PDLSCs增殖能力，礦化誘導(dǎo)后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx-2）、堿性磷酸酶（ALP）和I型膠原（Col-1）成骨相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果 MTT法檢測(cè)顯示高糖組OD值較低糖組和正常對(duì)照組低（P＜0.05）；21天成骨誘導(dǎo)后，高糖組礦化結(jié)節(jié)面積少于低糖組和正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）；成骨誘導(dǎo)期間，高糖組ALP、Runx2和Col-1誘導(dǎo)前后相對(duì)倍增數(shù)低于低糖組和正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 高濃度葡萄糖抑制PDLSCs增殖能力和成骨分化能力。

牙周膜干細(xì)胞；高濃度葡萄糖；分化能力；增殖能力

牙周膜由致密的結(jié)締組織構(gòu)成，能夠?yàn)檠例l、牙槽骨等牙周支持組織提供組織再生的細(xì)胞，牙周組織包括血管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[1]，目前大量研究表明牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）擁有自我更新和多項(xiàng)分化能力，包括分化成神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞[2-5]，同時(shí)PDLSCs還表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)記物（STRO-1，CD-44，CD-73，CD-90和CD-105）[6]。

目前針對(duì)PDLSCs多項(xiàng)分化的研究中，很多學(xué)者在體外均能成功地將PDLSCs向成骨誘導(dǎo)分化[1-2，7]，而葡萄糖能夠影響機(jī)體間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)制衰老和線粒體的呼吸[8]，能夠?yàn)榧?xì)胞分子及其代謝中間產(chǎn)物提供足夠的能量[9]。筆者前期研究[10]也得出2型糖尿病患者來源的PDLSCs成骨能力較弱的結(jié)論，目前最佳的糖濃度（1100g/L、4500g/L）已經(jīng)用來研究干細(xì)胞的分化功能[11]和牙周膜成纖維細(xì)胞多項(xiàng)分化能力[12-14]，高濃度的葡萄糖（4500mg/L）可明顯抑制牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化能力及其細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)研究在不同葡萄糖濃度刺激下，牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基、鼠抗人STRO-1單克隆抗體（R&D SYSTEMS公司，美國(guó)）、膠原酶、鼠抗人CD146單克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)）、一步法RT-PCR試劑盒（Takara，日本）、MTT（Sigma，美國(guó)）、胎牛血清（四季青，杭州）、胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))、細(xì)胞總RNA提取試劑盒、倒置顯微鏡以及照相系統(tǒng)（OLYMPUS，日本）、real time PCR儀器（Applied biosystems，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng) 牙周組織來源于臨床上因正畸治療需要拔除的13～23歲非糖尿病患者，共8名，年齡（17.5±3.9）歲，均來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔外科門診部，常規(guī)進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)[10]。

1.3 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化PDLSCs[10]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第1代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至100～150個(gè)/mL，接種于直徑10cm的一次性培養(yǎng)皿中，3mL/皿，培養(yǎng)貼壁后標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞并補(bǔ)液至8mL，常規(guī)培養(yǎng)7～10天，出現(xiàn)細(xì)胞克隆。

1.4 PDLSCs的初步鑒定[10]

1.4.1 克隆形成率 克隆形成數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量× 100%

1.4.2 免疫熒光細(xì)胞檢測(cè)波形絲蛋白、角蛋白、細(xì)胞表型分子CD146和STRO-1 分別取第二代克隆形成細(xì)胞5×103/孔接種于24孔板，4%多聚甲醛固定30min，加羊血清封閉30min，直接加鼠抗人CD146單克隆抗體（1：100稀釋）37℃孵箱孵育2h，加山羊抗小鼠IgG（1：100稀釋），37℃孵箱孵育40min，Hochest胞核襯染，洗盡后避光觀察、拍照。STRO-1、波形絲蛋白、角蛋白染色方法同CD146。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組：常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）組。低糖組：常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中含1100mg/L葡萄糖組。高糖組：常規(guī)α-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中含4500mg/L葡萄糖組[14]。

1.6 MTT法檢測(cè)不同濃度下細(xì)胞增殖能力[10]取第二代PDLSCs制成細(xì)胞懸液，1×104/孔接種于三個(gè)96孔板，常規(guī)培養(yǎng)2～3天后，每孔加MTT（5mg/mL）50μL，置37℃孵箱孵育4h，加150μL DMSO，避光震蕩15min，每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)副孔，三個(gè)空白對(duì)照孔，選擇490nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。連續(xù)檢測(cè)9天，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 成骨誘導(dǎo)及茜素紅染色[10]取第二代PDLSCs制成細(xì)胞懸液，2×104個(gè)細(xì)胞分別接種于三個(gè)6孔板中。常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖到孔底的70%時(shí)，換為不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)液（10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中含10mmol/mLβ-甘油酸鈉、50μg/mL維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、100μg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素），連續(xù)培養(yǎng)21天后棄原誘導(dǎo)液，4%多聚甲醛固定，0.1%茜素紅37℃孵箱染色，倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)。

1.8 RT-PCR檢測(cè)Runx-2、Col-1和ALPmRNA表達(dá)[10]分別收集不同濃度葡萄糖刺激下成骨誘導(dǎo)7天后的三組PDLSCs，用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，β-actin為內(nèi)參照。參照Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Primer primer5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)基因序列見表1。由Takara公司合成，反應(yīng)條件參考產(chǎn)品說明書。

表1 基因序列表

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，單因素方差分析比較三組MTT值、礦化結(jié)節(jié)面積和相關(guān)mRNA表達(dá)的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs的分離及純化 本實(shí)驗(yàn)用組織塊法培養(yǎng)PDLSCs，7～12天組織塊周圍有細(xì)胞爬出，之后1～2周左右達(dá)到80%匯集，篩選出的克隆細(xì)胞大多呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)為橢圓形，胞體較小，胞漿豐滿。

2.2 PDLSCs的初步鑒定

2.2.1 克隆形成率 有限稀釋法克隆后的細(xì)胞克隆形成率為（25.63±2.53）%（圖1，封二）。

2.2.2 波形絲蛋白、角蛋白、CD146和STRO-1的表達(dá) 免疫熒光細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有限稀釋法克隆后細(xì)胞角蛋白陰性表達(dá)（圖2A，封二），波形絲蛋白陽性表達(dá)（圖2B，封二），說明PDLSCs來源于中胚層；同時(shí)，檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表型標(biāo)記分子STRO-1、CD146，均呈陽性表達(dá)（圖2C、D，封二）。

2.3 細(xì)胞增殖能力 連續(xù)9天吸光光度值（OD值）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組不同濃度血糖刺激后PDLSCs呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞增殖能力和活性，三組細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖曲線為“S”型，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，第一天OD值組間比較無明顯差異。而在2～9天中，高糖組細(xì)胞增殖能力與活性受到明顯的抑制，正常對(duì)照組增殖能力最強(qiáng)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3，封二）。

2.4 鈣化結(jié)節(jié)形成 三組細(xì)胞成骨礦化液誘導(dǎo)后倒置顯微鏡下觀察可見米粒大小灰白色的小結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)第21天時(shí)，茜素紅染色后鏡下可見染成紅色鈣化結(jié)節(jié)，相同視野下，與正常對(duì)照組、低糖組比較，高糖組誘導(dǎo)后鈣化結(jié)節(jié)面積形成最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖4，封二）。

2.5 RT-PCR結(jié)果 三組PDLSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，分別對(duì)早期成骨基因Runx-2、ALP和Col-1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示三組均有較為明顯的成骨分化的表現(xiàn)，高糖組的成骨相關(guān)基因誘導(dǎo)后的倍增數(shù)較低糖組、正常對(duì)照組低（P＜0.05，P＜0.01）（圖5，封二）。

3 討 論

機(jī)體的成纖維細(xì)胞作為一種組織細(xì)胞，具有維持組織結(jié)構(gòu)、合成細(xì)胞外基質(zhì)和參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)等功能，PDLSCs作為牙周結(jié)締組織中的重要細(xì)胞，能夠合成不同的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原纖維，同時(shí)，PDLSCs還能夠分化為成骨樣細(xì)胞和成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，參與組織的修復(fù)與再生[8-9]，因此，PDLSCs的活性對(duì)牙周組織再生起著非常重要的作用。

糖尿病作為一種系統(tǒng)性疾病對(duì)機(jī)體其他的組織和器官具有很大的影響，高血糖能夠抑制組織器官細(xì)胞增殖分化功能，包括腎小管上皮細(xì)胞、胚胎系膜細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[13-14]，同時(shí)可明顯抑制成骨細(xì)胞的礦化能力[15]。

近年研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病是牙周炎發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素，加速牙周組織的破壞。牙周膜成纖維細(xì)胞（PDLCs）的增殖能力近年來也得到更多學(xué)者的重視，Nishimura等[12]研究發(fā)現(xiàn)不同葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞的增殖具有一定的影響，當(dāng)血糖＞18mmol/L時(shí)的高糖狀態(tài)下PDLCs增殖能力呈現(xiàn)降低的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)培養(yǎng)下的PDLCs過度表達(dá)纖維蛋白受體，從而抑制了這些細(xì)胞向血小板來源的生長(zhǎng)因子的趨化反應(yīng)。Ohgi等[18]研究學(xué)者研究高血糖對(duì)牙齦成纖維細(xì)和PDLCs增殖能力的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)高血糖對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖能力并無明顯的影響，而對(duì)PDLCs出現(xiàn)了明顯的抑制作用；Kim等[19]通過高糖刺激得出高糖狀態(tài)可以明顯抑制PDLCs的細(xì)胞活性與成骨項(xiàng)分化，高糖刺激下可積累大量VLA-5促使細(xì)胞外基質(zhì)和整合素的分泌，增強(qiáng)了PDLCs的自身吸附能力，從而導(dǎo)致PDLCs在牙周組織損傷中細(xì)胞活性能力（遷徙能力）的減弱，延長(zhǎng)修復(fù)周期[12]。同時(shí)高糖狀態(tài)可能通過激活caspase-3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)PDLCs的凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)中多次檢測(cè)高糖刺激后PDLSCs的增殖情況，結(jié)果顯示在高糖狀態(tài)下PDLSCs的增殖能力和細(xì)胞活性受到明顯的抑制，該結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)與前期研究學(xué)者研究PDLCs相似。而臨床上血糖未控制的糖尿病患者血清中血糖含量均較高（大多高于4500mg/L），因此可以認(rèn)為糖尿病患者牙周損傷嚴(yán)重的可能原因是高血糖狀態(tài)下抑制了牙周組織中PDLSCs的細(xì)胞活性，減少了PDLSCs向PDLCs分化，最終影響組織修復(fù)。

很多學(xué)者研究長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)對(duì)骨組織的影響，發(fā)現(xiàn)血糖未控制的糖尿病患者，骨組織的改建和代謝能力降低[21]，說明高血糖能夠影響機(jī)體骨密度和骨代謝，容易引起骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥，本實(shí)驗(yàn)的另外一個(gè)主要目的是觀察高糖刺激下PDLSCs在骨形成過程中鈣化結(jié)節(jié)面積及早期相關(guān)基因的表達(dá)，研究高糖對(duì)PDLSCs成骨能的影響。

與牙齦成纖維細(xì)胞比較，PDLCs具有更高的ALP活性、更高細(xì)胞表型分子骨涎蛋白表達(dá)和更多的細(xì)胞外基質(zhì)分泌[22]。研究者利用成骨礦化液對(duì)PDLCs進(jìn)行誘導(dǎo)，PDLCs能夠向成骨樣組織分化[19]?；谇捌谘芯康恼T導(dǎo)條件，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示對(duì)照組和低糖組在誘導(dǎo)14天左右出現(xiàn)了早期顆粒樣大小的礦化結(jié)節(jié)，隨著天數(shù)的增加，礦化結(jié)節(jié)面積增加，第21天時(shí)，對(duì)照組和低糖組的礦化面積可以用肉眼辨認(rèn)，而高糖組則不明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他研究學(xué)者結(jié)果相一致。

Runx-2、ALP和Col-1都是成骨的早期基因，ALP是骨形成標(biāo)志[23]，Runx-2表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的開始，也是骨形成過程中最早和最具特異性的標(biāo)志[24]，是ALP、Col-1等早期成骨基因的上游基因，正是因?yàn)镽unx-2的作用刺激了ALP、Col-1等早期成骨細(xì)胞相關(guān)基因，促進(jìn)成骨分化。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果我們提出這樣的假設(shè)：因高糖組PDLSCs細(xì)胞成骨分化過程中Runx-2基因倍增數(shù)明顯較對(duì)照組和低糖組低，上游基因表達(dá)能力下降，從而影響下游的ALP、Col-1的表達(dá)，進(jìn)而影響了PDLSCs成骨向分化的能力。該結(jié)果與 Sawangmake等[25]研究高糖狀態(tài)對(duì)PDLSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化趨勢(shì)相似，但具體調(diào)控機(jī)制目前未見報(bào)道。因此，對(duì)于糖尿病患者，無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，良好的血糖控制，能夠使牙周組織更加健康，延長(zhǎng)牙齒在牙槽骨上的使用時(shí)間[26]。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面說明了PDLSCs具有向成骨樣細(xì)胞分化的潛能，另外方面則體現(xiàn)了不同葡萄糖濃度對(duì)PDLSCs功能的影響，在高葡萄糖濃度的誘導(dǎo)作用下，PDLSCs對(duì)誘導(dǎo)條件的刺激分化能力出現(xiàn)“反應(yīng)性降低”，導(dǎo)致PDLSCs向成骨分化能力減弱，從而解釋糖尿病狀態(tài)可能是通過影響PDLSCs成骨能力，加速糖尿病患者牙周炎發(fā)生發(fā)展，抑制骨形成，加重病變程度。但由于本實(shí)驗(yàn)研究限于體外，未體現(xiàn)PDLSCs在體內(nèi)的生物學(xué)特性，因此高濃度葡萄糖對(duì)PDLSCs影響的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

［1］International Diabetes Federation.Facts&figures：diabetes prevalence［DB］.http://www.diabetesatlas.org.

［2］Collin HL，Uusitua M，Niskanen L，et al.Periodontal findings in elderly patients with non-insulin dependent diabetes mellitus［J］.JPeriodontol，1998，69（9）：962-966.

［3］Sandberg GE，Sundberg HE，F(xiàn)jellstrom CA，et al.Type 2 diabetes and oral health：A comparison between diabetic and non-diabetic subjects［J］.Diab Res Clin Prac，2000，50（1）：27-34.

［4］張建全，潘亞萍，馬麗，等.2007年遼寧省2型糖尿病患者牙周炎患病情況調(diào)查［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)，2009，44（11）：668-671.

［5］桑曉紅，張麗，劉健，等.墨玉縣農(nóng)村維吾爾族牙周炎與代謝綜合征相關(guān)性的流行病學(xué)研究［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26（9）：745-748.

［6］Lǒe H.Periodontal disease The sixth complication of diabetesmellitus［J］.Diabetes Care，1993，16（1）：329-334.

［7］Krentz AJ，Bailey CJ.Oral antidiabetic agents：current role in type 2 diabetes mellitus［J］.Drugs，2005，65（3）：385-411.

［8］Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet2004，364（9429）：149-155.

［9］Liu Y，Zheng Y，Ding G，et al.Periodontal Ligament Stem Cell-Mediated Treatment for Periodontitis in Miniature Swine［J］.STEM CELLS，2008，26（4）：1065-1073.

［10］夏佳佳，王嵐，劉琪，等.2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干細(xì)胞骨向分化研究［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（5）：624-629。

［11］Pihlstrom BL，Michalowicz BS，Johnson NW.Periodontal diseases［J］.Lancet，2005，366（9499）：1809-1820.

［12］Nishimura F，Naruishi K，Yamada H，et al.High glucose suppresses cathepsin activity in periodontal-ligament-derived fibroblastic cells［J］.JDent Res，2000，79（8）：1614-1617.

［13］Ziyadeh FN，Simmons DA，Snipes ER，et al.Effect ofmyoinositol on cell proliferation and collagen transcription and secretion in proximal tubule cells cultured in elevated glucose［J］.JAm Soc Nephrol，1991，1（11）：1220-1229.

［14］Moran A，Brown DM，Kim Y，et al.Effects of IGF-I and glucose on protein and proteoglycan synthesis by human fetalmesangial cells in culture［J］.Diabetes，1991，40（10）：1346-1354.

［15］García-Hernández A，Arzate H，Gil-Chavarría I，et al.High glucose concentrations alter the biomineralization process in human osteoblastic cells［J］.Bone，2012，50（1）：276-288.

［16］Noack B，Aslanhan Z，BouéJ，et al.Potential association of paraoxonase-1，type 2 diabetes mellitus，and periodontitis［J］.JPeriodonto，2013，84（5）：614-623.

［17］de Oliveira Diniz CK，Corrêa MG，Casati MZ，et al.Diabetesmellitusmay increase bone loss after occlusal trauma and experimental periodontitis［J］.JPeriodontol，2012，83（10）：1297-303.

［18］Ohgi S，Johnson P.Glucosemodulates growth of gingival fibrpblasts and periodontal ligament cells：correlation with expression of basic fibroblast growth factor［J］.JPeriodontal Res，1996，31（8）：579-588.

［19］Kim HS，Park JW，Yeo SI，et al.Effects of high glucose on cellular activity of periodontal ligament cells in vitro［J］. Diabetes Res Clin Pract，2006，74（1）：41-47.

［20］Liu J，Jiang Y，Mao J，et al.High levels of glucose induces

a dose-dependent apoptosis in human periodontal ligament fibroblasts by activating caspase-3 signaling pathway［J］.Appl Biochem Biotechnol，2013，170（6）：1458-1471.［21］Follak N，Kl?ting I，Wolf E，et al.Improvingmetabolic control reverses the histomorphometric and biomechanical abnormalities of an experimentally induced bone defect in spontaneously diabetic rats［J］.Calcif Tissue Int，2004，74（6）：551-560.

［22］Ivanovski S，Haase HR，Bartold PM.Expression of bone matrix protein mRNAs by primary and cloned cultures of the regenerative phenotype of human periodontal fibroblasts［J］.JDent Res，2001，80（7）：1665-1671.

［23］Lind M，Deleuran B，Theserup-Pedersen K，et al.Chemotaxis of human osteoblasts effects of osteotropic growth factors［J］.APMS，1995，103（2）：140-146.

［24］Takeda S，Bonnamy JP，Owen MJ，et al.Continuous expression of Cbfa1 in nonhypertrophic chondrocytes uncovers its ability to induce hypertrophic chondrocyte differentiation and partially rescues Cbfa1-deficientmice［J］.Genes Dev，2001，15（4）：467-481.

［25］Sawangmake C，Pavasant P，Chansiripornchai P，et al.High Glucose Condition Suppresses Neurosphere Formation by Human Periodontal Ligament-Derived Mesenchymal Stem Cells［DB］.JCell Biochem，2013 Dec 16.doi：10.1002/jcb. 24735.[Epub ahead of print]

［26］Demmer RT，Holtfreter B，Desvarieux M，et al.The influence of type 1 and type 2 diabetes on periodontal disease progression:prospective results from the Study of Health in Pomerania［J］.Diabetes Care，2012，35（10）：2036-2042.

（收稿：2015-03-02 修回：2015-03-30）

Effects of High Glucose on Proliferation and Osteogenic Differentiation of Periodontal Ligament Stem Cellsin Vitro

XIA Jiajia1,WANG Lan2,ZHANG Yanzhen1. 1 Department of Cosmetic Dentistry,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China;2 Department of Conservative Dentistry and Endodontics,the Affiliated Hospital of Stomatology,Chongqing Medical University;Chongqing Research Center for Oral Disease and Biomedical Sciences,Chongqing(401147),China

Objective To investigate the effect of high glucose concentration on the cellular activity and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro.M ethods PDLSCs from non-diabetic patients were obtained and cultured with tissue block method in a low glucose-concentration medium（1100mg/L of glucose）or in a high glucose-concentration medium（4500mg/L of glucose）,respectively,for 14d.Zero mg/L of glucose group served as blank control.MTT assay was used to evaluate cellular viability.The osteogenic differentiation capacity of PDLSCs was determined by alizarin red staining after mineralization induction and real time PCR for detection of Runx-2,alkaline phosphatase（ALP）,and collagen I genes.Results MTT assay results showed that the OD value in high glucose group was lower than that in low glucose group（P＜0.05，P＜0.01）.After 21-day culturing,the calcified area was reduced and the expression of Runx-2,ALP,and collagen I genes to the toal culture dish of PDLSCs in high glucose group were lower than those in low glucose group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion High glucose inhibits the proliferation and differentiation of PDLSCs.

periodontal ligament stem cells;high glucose;differentiation;proliferatio

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院綜合牙科（杭州 310052）；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶 401147）

夏佳佳，Tel：18857862012