缺血后處理對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響

陳碧瑤 李 斌 韋思明 王 力

缺血后處理對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響

陳碧瑤 李 斌 韋思明 王 力

目的 觀察缺血后處理對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響。方法 60只成年雄性SD大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組和缺血后處理組，每組20只。對照組行左側睪丸假手術。缺血再灌注組予左側睪丸扭轉720度，2h后復位。缺血后處理組予左側睪丸扭轉720度，2h后行缺血后處理，即先將睪丸復位，血流再灌注10s，然后將睪丸再次扭轉720度，使睪丸缺血10s，反復6個循環(huán)，最后睪丸復位，血流持續(xù)灌注。復位后4h，每組處死大鼠10只，行左側睪丸切除術，測定睪丸組織丙二醛水平。復位后3個月，各組處死剩余的大鼠，行左側睪丸切除術，分析睪丸生精功能。結果睪丸組織丙二醛含量缺血后灌注組＞缺血后處理組＞處理組［（2.73±0.34）、（1.86±0.29）、（1.45± 0.20）mmol/mg］（P＜0.05），睪丸生精功能對照組＞缺血后處理組＞缺血后灌注組［（22.03±1.97）、（15.13±1.81）、（2.14±0.42）×106］（P＜0.05）。結論 缺血后處理對睪丸缺血再灌注損傷有保護作用，其作用機制可能與降低活性氧水平有關。

大鼠；睪丸缺血再灌注損傷；缺血后處理；睪丸扭轉復位

睪丸扭轉又稱精索扭轉，是指精索沿其縱軸旋轉，精索內血管受壓阻塞，導致睪丸缺血甚至梗死。25歲以下男性發(fā)病率為1/4000，因此該病并非少見[1]。復位是治療睪丸扭轉的主要方法，可以恢復睪丸血液供應，避免發(fā)生梗死。但是睪丸復位后往往出現(xiàn)萎縮，生精功能障礙[2]。睪丸扭轉復位后的損傷是一個典型的缺血再灌注損傷。本研究建立大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型，探討缺血后處理對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動 物 成年雄性SD大鼠（250～300g）60只（上海實驗動物中心），動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012－0002。

1.2 試 劑 丙二醛試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，聚乙二醇辛基苯基醚、氯化鈉﹑伊紅和疊氮鈉購自Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型建立及其處理采用隨機數(shù)余數(shù)分組法將60只成年雄性SD大鼠分為對照組、缺血再灌注組和缺血后處理組，每組20只。將氯胺酮（50mg/kg）注入大鼠腹腔內麻醉。所有手術在無菌條件下施行。在大鼠左側髂腹股溝做一切口，施行以下手術。對照組：通過此切口取出左側睪丸，用11/0無創(chuàng)傷縫線穿過睪丸白膜。然后通過原切口放睪丸入陰囊內，縫合切口。缺血再灌注組：通過同樣的切口取出左側睪丸，將睪丸繞精索逆時針旋轉720度，在睪丸白膜與陰囊之間用11/0無創(chuàng)傷縫線縫合固定，保持睪丸缺血狀態(tài)。2h后，拆除縫線，將睪丸反方向旋轉720度復位，睪丸恢復血液供應，依舊存活，放睪丸入陰囊內，縫合切口。缺血后處理組：通過同樣的手術方式造成睪丸缺血，2h后行缺血后處理，即先將睪丸復位，血流再灌注10s，然后將睪丸再次旋轉720度，使睪丸缺血10s，反復6個循環(huán)。最后睪丸復位，血流持續(xù)灌注。復位后4h，每組處死大鼠10只，行左側睪丸切除術，測量丙二醛水平。復位后3個月，處死剩余大鼠，行左側睪丸切除術，分析睪丸生精功能。

2.2 睪丸組織丙二醛水平測定 將睪丸組織在1.5%氯化鉀溶液中攪勻，制成10%組織勻漿。用硫代巴比妥酸法測定睪丸組織中丙二醛水平。

2.3 睪丸生精功能分析 通過檢測睪丸重量和每日精子產(chǎn)量評估睪丸生精功能。左側睪丸切下后稱重，然后在50mL溶液（含0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、0.154M氯化鈉﹑伊紅溶液和2%疊氮鈉）中攪勻。用血細胞計數(shù)板測量精子細胞核數(shù)目，其結果作為每日精子產(chǎn)量。

3 實驗結果

3.1 三組大鼠睪丸丙二醛水平比較 相比于對照組，缺血再灌注組睪丸的丙二醛水平顯著升高（P＜0.05）；缺血后處理組睪丸的丙二醛水平明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05），見表1。

3.2 三組大鼠睪丸生精功能比較 缺血再灌注組睪丸的重量和每日精子產(chǎn)量明顯低于對照組（P＜0.05）；缺血后處理組睪丸的上述指標顯著高于缺血再灌注組（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠睪丸組織丙二醛水平﹑睪丸重量及每日精子產(chǎn)量比較（±s）

表1 三組大鼠睪丸組織丙二醛水平﹑睪丸重量及每日精子產(chǎn)量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05

組別對照組缺血再灌注組缺血后處理組只數(shù)10 10 10丙二醛水平（nmol/mg）1.45±0.20 2.73±0.34* 1.86±0.29#睪丸重量（g）1.95±0.11 1.10±0.15* 1.62±0.18#每日精子產(chǎn)量（×106/g）22.03±1.97 2.14±0.42* 15.13±1.81#

4 討論

睪丸扭轉復位是一個缺血再灌注過程，在這一過程中，產(chǎn)生了過量的活性氧，如超氧陰離子、過氧化氫等[3]。活性氧產(chǎn)生機制：缺血時，ATP生成減少，導致膜泵功能障礙，大量鈣離子進入中性粒細胞內，引起NADPH氧化酶活性增加；再灌注時，大量的氧隨血液進入缺血組織，NADPH氧化酶將氧轉化為超氧陰離子、過氧化氫等活性氧[4]。活性氧很難直接定量，因為半衰期很短。丙二醛是活性氧引起細胞脂質過氧化的穩(wěn)定末端產(chǎn)物，通常被作為活性氧的標志[3]。本研究顯示，睪丸扭轉復位引起睪丸內丙二醛水平顯著升高，說明睪丸扭轉復位后，產(chǎn)生了過量的活性氧。此外，睪丸扭轉復位后，生精功能也嚴重受損，包括睪丸重量減輕和每日精子產(chǎn)量下降。活性氧能氧化細胞脂質、蛋白和DNA,導致細胞功能障礙，甚至死亡[5]。已有研究證實，睪丸扭轉復位后，活性氧的過量產(chǎn)生是引起生精功能損傷的主要原因[3]。因此，減少活性氧的過量產(chǎn)生有利于保護睪丸生精功能。

據(jù)報道，再灌注起始階段，睪丸﹑心肌﹑腎臟﹑腸等臟器的血液灌注量要高于缺血前，被稱之為過度灌注[6]。過度灌注導致大量氧進入缺血組織內，引起活性氧過量產(chǎn)生，造成組織損傷[7]。針對這一現(xiàn)象，缺血后處理可以減少缺血臟器在起始階段的血液灌注量，降低活性氧產(chǎn)生，從而減輕臟器的缺血再灌注損傷。在犬的心肌缺血再灌注實驗中運用此法，成功地減輕了心肌的損傷[6]。其他研究者在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，該方法也能減輕肝﹑腎﹑腦等臟器的缺血再灌注損傷[8]。因此，我們嘗試使用該方法治療大鼠睪丸缺血再灌注損傷。結果顯示，缺血后處理可明顯降低睪丸內的丙二醛水平，提高了睪丸重量和每日精子產(chǎn)量。這表明缺血后處理減少了活性氧產(chǎn)生，保護了睪丸生精功能。

［1］Uyeturk U，Terzi EH，Gucuk A，et al.Prevention of torsioninduced testicular injury by Rhodiola rosea［J］.Urology，2013，82（1）：254.

［2］Cayan S，Saylam B，Tiftik N，et al.Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor，Y-27632，on oxidative stress，spermatogenesis，and apoptosis［J］.Urology，2014，83（3）：675.

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（收稿：2014-09-07 修回：2014-09-14）

Effect of Ischemic Post-Conditioning on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

CHEN Biyao,LIBin,WEI Siming,WANG Li. Department of Clinical Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou(310053), China

Objective To investigate the effect of ischemic post－conditioning on testicular ischemia－reperfusion (IR)injury in rats.Methods Sixty adult male Sprague－Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,IR group,and ischemic post－conditioning group,with 20 rats in each group.Control group underwent a sham operation on the left testis.In IR group,the left testis was rotated 720°for 2h,then detorsion was performed.In ischemic post－conditioning group,the left testis was rotated 720°for 2h,then ischemic post－conditioning was performed.First,testicular detorsion was done for 10－second blood flow reperfusion.Then,the left testis was rotated 720°again for 10－second ischemia.Such procedures were repeated 6 times.Lastly,testicular detorsion was performed for persistent blood flow reperfusion.One half of the rats in each group were sacrificed at 4h after detorsion,and left orchiectomy was done for measurement of malondialdehyde level.The remainder were killed at 3 months after detorsion,and left orchiectomy was performed for analysis of testicular spermatogenesis.Results Testicular torsion－detorsion caused a significant increase in the malondialdehyde level in the testes（2.73±0.34 vs 1.45± 0.20mmol/mg,P＜0.05）and a significant decrease in testicular spermatogenesis[（2.14±0.42）×106vs（22.03±1.97）× 106,P＜0.05].Ischemic post－conditioning significantly decreased malondialdehyde level in testes（1.86±0.29 vs 2.73± 0.34mmol/mg,P＜0.05）,and improved testicular spermatogenesis[（15.13±1.81）×106vs（2.14±0.42）×106,P＜0.05].Conclusion Ischemic post－conditioning has a protective effect on testicular ischemia－reperfusion injury.The effect is related to reduction in production of reactive oxygen species in testes.

rats；testicular ischemia－reperfusion injury；ischemic post－conditioning；testicular torsion－detorsion

浙江醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學系（杭州 310053）

韋思明，Tel：15268133671；E－mail：wsm1971@hotmail.com