P53-MDM 2界面的肽類及擬肽類抑制劑的研究進(jìn)展

李 翔，鄒 燕，吳茂誠，黃 婷，胡宏崗，吳秋業(yè)（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機化學(xué)教研室，上海 200433）

·綜述·

P53-MDM 2界面的肽類及擬肽類抑制劑的研究進(jìn)展

李 翔，鄒 燕，吳茂誠，黃 婷，胡宏崗，吳秋業(yè)（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機化學(xué)教研室，上海 200433）

當(dāng)前，腫瘤疾病以日益增高的發(fā)病率越來越受到人們的重視。抑制P 53-MDM 2的相互作用已經(jīng)成為治療癌癥藥物設(shè)計的重要靶標(biāo)，通過各種藥物篩選手段，研究人員發(fā)現(xiàn)了許多肽類及小分子抑制劑。綜述近年來國內(nèi)外關(guān)于肽類及擬肽類的P53-MDM 2抑制劑的研究進(jìn)展。

P53-MDM2；肽；抑制劑

抑癌蛋白P53在誘導(dǎo)細(xì)胞捕捉、凋亡以及衰老方面起重要作用［1，2］，處于正?；钚缘腜53能有效抑制腫瘤的生長，素有“細(xì)胞衛(wèi)士”的稱號［3］。但P53的活性受控于癌基因蛋白MDM2，該蛋白能直接與P53相互作用，從而抑制P53發(fā)揮正常功能［4，5］。事實上，50%的腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了MDM2的過度表達(dá)。近期研究表明：P53蛋白的3個殘基（Phe 19、Trp 23和Leu 26）伸入到MDM 2的疏水性裂縫，形成與MDM2的相互作用［6，7］。因此，抑制P53-MDM2的相互作用已經(jīng)成為抗癌藥物設(shè)計的重要靶標(biāo)。

目前P53-MDM2抑制劑主要分為肽類和小分子兩大類［8-15］。小分子MDM2抑制劑有順式咪唑啉類［11］、苯二氮 類［14］和吲哚酮螺環(huán)類［15］等，其中吲哚酮螺環(huán)類［15］已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。本文主要綜述近年來P53-MDM2相互作用的肽類抑制劑的研究進(jìn)展。

使用肽類物質(zhì)去抑制蛋白-蛋白的相互作用［16］已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)活性化合物的一條新的、有潛力的途徑。與傳統(tǒng)小分子抑制劑相比，肽類擁有更高的親和力和特異性［17］，使其更加容易結(jié)合并拮抗靶蛋白。然而，肽類化合物存在兩大技術(shù)難題：體內(nèi)不穩(wěn)定以及透膜能力不強。為了克服肽類抑制劑存在的這兩大難題，科研工作者做了許多努力，現(xiàn)將近年來關(guān)于P53-MDM2的肽類及擬肽類抑制劑的研究進(jìn)展作一綜述。

1 高親和力的MDM2的肽類及擬肽類的研究

隨著噬菌體展示技術(shù)、天然化學(xué)耦合技術(shù)以及固相合成技術(shù)的發(fā)展，許多高親和力的納摩爾級別的肽類MDM2抑制劑被發(fā)現(xiàn)，其中活性最強的主要有PM I、PDI、ATSP等幾大類。

表1 PMI以及衍生物的序列

然而，這類肽類抑制劑雖然與靶標(biāo)蛋白MDM2具有非常好的親和力，但是由于缺少一定的細(xì)胞膜通透性，該類肽類抑制劑未能顯現(xiàn)出與之靶蛋白活性相對應(yīng)的細(xì)胞水平的抗增殖活性。

1.2 ATSP及其衍生物 Chang等［19］報道了一種強效的MDM2的肽類抑制劑ATSP，其中ATSP-7041的IC50值達(dá)到了0.9nmol／L（圖1），所報道的ATSP系列的肽（表2）Kd值均達(dá)到了納摩爾級別，而其作用的關(guān)鍵在于穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)。該肽類抑制劑通過類似裝訂的方式，在一定程度上以較小的肽段模擬了生物體內(nèi)重要的α螺旋結(jié)構(gòu)，而這在P53-MDM 2的相互作用中是至關(guān)重要的，從而獲得了與靶蛋白MDM2非常好的結(jié)合能力，X衍射晶體結(jié)構(gòu)也證明了實驗假設(shè)。

圖1 ATSP及其衍生物的結(jié)構(gòu)

表2 ATSP及其衍生物的序列

難能可貴的是，ATSP類抑制劑在體外甚至體內(nèi)都展現(xiàn)出了一定的生物活性，同時還具有良好的藥動學(xué)性質(zhì)，這可能與之穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的良好的細(xì)胞膜通透性關(guān)系密切。免疫印跡同樣也證明了其對細(xì)胞的作用機制就是抑制了細(xì)胞內(nèi)的MDM2，從而激活了抑癌蛋白P53的作用。

1.3 St ingin及其衍生物 Li等［20，21］以一種蜂毒明肽Apam in為模板，基于該結(jié)構(gòu)全新設(shè)計合成了一系列PM I的后續(xù)衍生物（表3）。蜂毒明肽作為一種Ca2＋激活的K＋通道阻斷劑，包含了一個N端的回環(huán)結(jié)構(gòu)，同時其C端的α螺旋結(jié)構(gòu)由2個二硫鍵所穩(wěn)定（Cys1-Cys11和Cys3-Cys15），本身就具備了很好的細(xì)胞膜通透性。筆者選取了P53-MDM2相互作用界面的關(guān)鍵殘基Phe19、Tyr22、Trp23和Leu26，與Apam in上的螺旋區(qū)域結(jié)構(gòu)相結(jié)合，全新設(shè)計了Stingin1～5，其對靶蛋白MDM2的Kd值均達(dá)到了納摩爾級別。

表3 St i ng i n系列肽的序列

1.4 AA肽類 Hu等［22］設(shè)計合成了一組新的擬肽類MDM2抑制劑，即AA肽（圖2），與P53衍生肽和MDM2的結(jié)合能力基本相當(dāng)，是由多個N?；蚇乙基化的氨基酸組成，由經(jīng)過修飾的非天然氨基酸組成的AA肽具有一定的抗酶水解能力，從而提高了該類肽抑制劑在細(xì)胞體內(nèi)的穩(wěn)定性，這顯示出AA肽在擬肽類物質(zhì)應(yīng)用上的良好前景。

圖2 AA肽的結(jié)構(gòu)

1.5 KPY類及其衍生物 Noguchi等［23］利用化學(xué)排列的方法，通過篩選內(nèi)部的化合物庫，發(fā)現(xiàn)了一系列新的擬肽類的MDM 2抑制劑（圖3），其與MDM 2的結(jié)合常數(shù)基本與P53相近。值得一提的是，該類擬肽抑制劑在細(xì)胞水平上表現(xiàn)出一定的活性，表明該擬肽類抑制劑具有一定的細(xì)胞膜通透性。從它的代表性結(jié)構(gòu)中可以看出，將芳香環(huán)甲基化以及將吲哚環(huán)芳香磺?；赡軐﹄念愐种苿┑姆€(wěn)定性以及細(xì)胞膜通透性具有一定的幫助作用。

圖3 KPY類肽的代表性結(jié)構(gòu)

1.6 天然環(huán)肽類MDM2抑制劑 Duncan等［24］從真菌的代謝產(chǎn)物中分離得到了一種MDM 2的環(huán)肽類的抑制劑chlorofusin，IC50＝4.6μmol／L，不久Lee等［25］完成了對chlorofusin的全合成。這不僅證明了環(huán)肽在抑制P53-MDM2相互作用時有一定的前景，也說明了在天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，P53-MDM 2抑制劑的發(fā)現(xiàn)也是可預(yù)期的。

1.7 其他 Sakurai等［26］利用寡糖構(gòu)象與P53關(guān)鍵殘基構(gòu)象的相似性，設(shè)計合成了一系列三糖的衍生物，并驗證了其對P53-MDM2相互作用的抑制效果。從而看出，糖肽有可能在下一步的MDM 2的抑制劑研究上成為一個重要方向。另外，Phan等［27］利用噬菌體展示技術(shù)，以MDM2受體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，設(shè)計了一系列納摩爾級別的12肽，即pDI，其IC50＝8nmol／L，pDI序列為L T F E H Y W A Q L T S。

2 增強P53-MDM 2界面肽類抑制劑的細(xì)胞膜通透性研究

高效的MDM2的肽類和擬肽類抑制劑的結(jié)構(gòu)與小分子類抑制劑相比，一般有較高的相似性，X衍射晶體技術(shù)基本已經(jīng)確證了P53-MDM2相互作用的關(guān)鍵殘基，所以肽類的MDM2的抑制劑與小分子相比，具有更高的親和力。然而，正如前文所述，肽類化合物一般透膜效果不理想，很大程度上限制了蛋白-蛋白相互作用的肽類抑制劑的發(fā)展，現(xiàn)將增強肽類化合物細(xì)胞膜通透性的研究進(jìn)展總結(jié)如下。

2.1 D型肽類抑制劑 由于天然氨基酸多數(shù)為L型氨基酸，而由天然氨基酸組成的蛋白或者肽段一般形成的是α螺旋，這樣的肽段雖然親和力很強，但多數(shù)不能透過細(xì)胞膜，且易于水解。Liu等［28］利用左手螺旋的方法，在噬菌體展示技術(shù)的幫助下，成功找到了針對L型靶標(biāo)的D型肽類構(gòu)象的抑制劑，在與MDM2結(jié)合能力基本沒有損失的情況下，大大增強了肽類抑制劑在體內(nèi)的穩(wěn)定性以及細(xì)胞膜的通透性。研究表明D型異構(gòu)化的非天然肽類抑制劑具有較好的前景［29］。

2.2 β肽類抑制劑 通常在想要提高肽類物質(zhì)的穩(wěn)定性以及細(xì)胞膜的通透性時，人們采取的重要方法就是使用非天然的氨基酸［28-31］，上述D型氨基酸就是非天然氨基酸的一種，而由D型氨基酸組成的D型肽類抑制劑形成的α螺旋與天然α螺旋較為相似。

與D型肽類抑制劑相比較，雖然β氨基酸組成的肽段的螺旋結(jié)構(gòu)與天然螺旋結(jié)構(gòu)有所區(qū)別，然而，在模仿疏水相互作用時，β肽類構(gòu)成的螺旋結(jié)構(gòu)能夠很好地模擬蛋白之間的相互作用。Harker等［30］以及Hintersteiner等［31］利用β右手螺旋原理設(shè)計出的肽類抑制劑具有良好的細(xì)胞膜通透性，如圖4所示，i、i＋4和i＋7所組成的天然α螺旋能夠很好的被β肽中i、i＋3、i＋6所組成的螺旋結(jié)構(gòu)所模擬（圖4）。

圖4 β肽類抑制劑模擬的α螺旋

2.3 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的應(yīng)用 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域（PTD）是指有能力透過細(xì)胞膜的蛋白區(qū)域，PTD如今已經(jīng)在蛋白運輸系統(tǒng)中占有相當(dāng)重要的地位。在多數(shù)PTD中，高精氨酸是非常重要的一種。Yamada等［32］利用11個A rg作為PTD，與核定位序列（NLS）以及層粘連蛋白連接到P53蛋白序列上，大大增強了P53的細(xì)胞膜通透性。

Li等［33］利用脂質(zhì)體為D-PM Iβ的載體，以c（RGDyK）為PTD，同時將D型的肽棕櫚?；?，從而達(dá)到透膜的效果，其通過RGD連接的肽類抑制劑透膜后對P53野生型的細(xì)胞株具有一定的選擇性，奇怪的是，當(dāng)用9個Arg作為PTD時，該抑制劑在P53野生或者缺失型細(xì)胞株上沒有明顯的選擇性。

2.4 肽的自身排列 自身排列的肽的納米結(jié)構(gòu)具有折疊的二級結(jié)構(gòu)，可以模擬蛋白的功能。Jeong等［34］利用α螺旋穩(wěn)定的自身排列的肽的納米結(jié)構(gòu)，將P53肽段套入一段β折疊的片段中，再將該結(jié)構(gòu)進(jìn)行自身排列，組成的納米結(jié)構(gòu)正好可與MDM2結(jié)合，這一方法不僅增強了P53肽段的透膜性質(zhì)，更大大增加了P53肽段在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。

2.5 氨基酸之間基團的連接與距離的匹配 為了使關(guān)鍵殘基的作用得到最大的利用，同時增強肽類物質(zhì)的穩(wěn)定性以及細(xì)胞膜的通透性，常常在肽中氨基酸（主要為半胱氨酸）之間連接一段基團，使得其余關(guān)鍵殘基的螺旋結(jié)構(gòu)得到保證，從而顯著增強透膜能力。

Muppidi等［35，36］設(shè)計了一組雙芳環(huán)亞基溴的結(jié)構(gòu)作為半胱氨酸的剛性距離匹配的連接片段（圖5），增強了肽類片段細(xì)胞膜的通透性以及穩(wěn)定性。Madden等［37］利用1，3偶極光誘導(dǎo)環(huán)加成反應(yīng)，在PDI的2個氨基酸殘基之間加入含有四唑以及烷烴鏈的片段，使得其α螺旋結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定，從而起到透膜效果。

圖5 代表性的連接片段結(jié)構(gòu)

3 小結(jié)

腫瘤日益成為危害人類健康的頭號殺手，尋找低毒、有效的抗腫瘤藥物已迫在眉睫。肽類以及擬肽類化合物以其高度的親和力、良好的特異性和微弱的毒性已經(jīng)越發(fā)受到研究者的關(guān)注。本綜述總結(jié)國內(nèi)外肽類MDM 2抑制劑的研究進(jìn)展，旨在為其研發(fā)工作打下基礎(chǔ)。

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Research progress of inhibitors of peptides and peptidom imetic acting on P 53-MDM2interface

LIXiang，ZOU Yan，WU Maocheng，HUANG Ting，HU Honggang，WU Qiuye（Department of Organic Chem istry，School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

Tumor diseases have attracted great attention of the society because of the increasing morbidity in recent years.To inhibit the P53-MDM2interaction has become an important target for design of cancer drug，and a lotof peptide and smallmolecule inhibitors have been found with various kinds of drug screening and research tools.This paper summarized the recent progress of the peptide and peptidom imetic inhibitors of P53-MDM2at home and abroad lately.

P53-MDM2；peptide；inhibitor

R73-3；Q51

A

1006-0111（2015）06-0494-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.004

2013-11-25

2014-03-31［本文編輯］李睿旻

李 翔，碩士研究生.E-mail：lixiangsmmu＠163.com

吳秋業(yè)，教授.研究方向：抗真菌、抗腫瘤藥物、寡糖及其他天然產(chǎn)物的全合成研究.E-mail：wuqy6439＠sohu.com