近紅外光譜法快速測定苧麻粗蛋白含量

彭玉梅，李雅玲，蔡敏，劉華強(qiáng)，朱學(xué)棟

(重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶涪陵408000)

1 引言

苧麻是中國特有的以紡織為主要用途的經(jīng)濟(jì)作物，中國的苧麻產(chǎn)量約占世界苧麻產(chǎn)量的90﹪以上，國際上稱為“中國草”。如今，苧麻的應(yīng)用出現(xiàn)多元化，除了用作傳統(tǒng)的紡織原料外，由于含有較高的粗蛋白質(zhì)，還可作為動物飼料。粗蛋白質(zhì)是由各種氨基酸以肽鍵連接而成的各種含氮有機(jī)化合物的總稱，它包括真蛋白質(zhì)和含氮物(氨化物)兩部分，是飼用苧麻的主要營養(yǎng)成分之一。苧麻嫩莖葉干料的粗蛋白(CP)含量在22%左右，是很好的植物蛋白飼料［1］。

粗蛋白含量高低是評價(jià)飼用苧麻品種和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培措施優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。目前，粗蛋白含量的化學(xué)測定一般采用凱氏定氮法，該法分析過程復(fù)雜，耗時(shí)耗力，各種化學(xué)試劑的使用不僅污染環(huán)境，對分析人員身體健康也有一定的危害。由于測量周期長，對飼用苧麻研究與應(yīng)用帶來諸多不便。

近紅外光(NIR)是指波長介于可見光與中紅外光之間的電磁波，其波長范圍約為780～2526 nm。近紅外光譜法是利用有機(jī)分子中的C－H、N－H、O－N等含氫基團(tuán)的倍頻與合頻吸收，以漫反射方式獲得光譜即近紅外譜區(qū)包含的物質(zhì)信息，主要用于有機(jī)物質(zhì)定性和定量分析的一種分析技術(shù)［2］。該方法不需要任何化學(xué)試劑，不產(chǎn)生污染，既安全又環(huán)保，屬于“綠色分析”技術(shù)，而且可對樣品內(nèi)多種成分同時(shí)測量，操作簡便，分析效率高，成本低。

針對應(yīng)用近紅外光譜法快速測定苧麻粗蛋白含量的可行性作了相關(guān)研究，應(yīng)用偏最小二乘法(PLS)建立苧麻粗蛋白的預(yù)測模型，并對預(yù)測模型進(jìn)行驗(yàn)證，以探討應(yīng)用近紅外光譜儀測定苧麻粗蛋白的可行性。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)儀器和主要試劑

近紅外光譜法實(shí)驗(yàn)儀器:聚光科技(杭州)股份有限公司生產(chǎn)的SUPNIR－2720近紅外分析儀，相應(yīng)的分析軟件和筆記本電腦。

分析儀器:KDY－9820型凱氏定氮儀，F(xiàn)A100A4分析天平，電熱鼓風(fēng)干燥箱，多功能快速消煮爐。

主要化學(xué)試劑:40%氫氧化鈉(質(zhì)量百分比)、2%硼酸(質(zhì)量百分比)、硫酸(濃硫酸，分析純)、雙氧水(化學(xué)純)、溴甲酚綠(分析純)、甲基紅(分析純)等。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備

材料來源于重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)的苧麻試驗(yàn)地，選取6個(gè)營養(yǎng)生長期中性質(zhì)差異較大的60個(gè)樣品，其中50個(gè)作為校正集樣品，10個(gè)作為驗(yàn)證集樣品。

樣品預(yù)處理:由于苧麻葉背密生銀白色茸毛，不易粉碎，先將1000 g左右苧麻樣品85℃烘干，用搖擺式高速粉碎機(jī)粉碎，再105℃烘干至恒重，用FZ102型植物粉碎機(jī)粉碎過篩，以備光譜掃描和化學(xué)分析。

2.2.2 化學(xué)值的測定

苧麻粗蛋白的化學(xué)測定采用凱氏定氮法［3］。每個(gè)樣品均進(jìn)行2次平行測定，同時(shí)，用空白測定作為對照，取其算術(shù)平均值，有效分析結(jié)果作為建模數(shù)據(jù)。

2.2.3 原始光譜的采集和預(yù)處理

用近紅外光譜儀采集50個(gè)樣品的光譜，其波長范圍約為1000～1799 nm。將樣品裝入光譜儀附帶的樣品盒內(nèi)，用玻片將樣品刮平，保持裝載的深淺和緊密均勻一致，采用漫反射的測樣方式使樣品盒勻速轉(zhuǎn)動，每個(gè)樣品掃描2次，其光譜數(shù)據(jù)的平均值作近紅外光譜分析。苧麻原始光譜圖如圖1所示。

從圖1可看出，50個(gè)樣品苧麻的光譜趨勢很相近，具有一定的代表性，但由于噪聲等各種因素的干擾導(dǎo)致光譜之間存在較大的平移。因此，為消除NIR光譜信號中的基線漂移，背景和光散射等各種干擾信號和噪聲，提高模型的預(yù)測精度，需對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理［4］，該處理過程由光譜儀附帶的聚光世達(dá)近紅外分析儀測量分析軟件(模型管理)進(jìn)行。該軟件提供了4種類型光譜預(yù)處理方法，包括標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)數(shù)，平滑和信號校正處理。經(jīng)過比較優(yōu)化之后，最后采用一價(jià)求導(dǎo)，Savitzky－Golay平滑，多元散射校正和均值中心化相結(jié)合的方式來完成。

圖1 苧麻的原始光譜圖Fig.1 The original spectra of ramie

3 模型的建立與驗(yàn)證

3.1 化學(xué)分析值

樣品的的選擇會直接影響建立模型的穩(wěn)定性和質(zhì)量的好壞，一般樣品的檢測參數(shù)范圍越廣，表示樣品分布越均勻，所建模型的穩(wěn)定性和適用性越好。分析所選用的50個(gè)苧麻樣品的化學(xué)值測定結(jié)果含量范圍為15.34% ～28.08%，平均值為20.09%，表明此批樣品粗蛋白有較寬的覆蓋范圍，可以用作近紅外光譜采集建立模型。

3.2 校正模型的建立

光譜預(yù)處理后，將光譜數(shù)據(jù)與樣品含量的化學(xué)值相關(guān)聯(lián)，建立校正樣本集。用光譜儀附帶的(模型管理)分析軟件，采用偏最小二乘法(PLS)和交叉驗(yàn)證法建立模型。建模中可根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)，剔除并校正異常樣品，直接調(diào)整建模的各個(gè)參數(shù)，確定最佳主因子數(shù)，進(jìn)行逐步優(yōu)化模型。主因子數(shù)是影響模型質(zhì)量的一個(gè)最主要參數(shù)，太大會出現(xiàn)“過擬合”現(xiàn)象，太小會出現(xiàn)“欠擬合”的現(xiàn)象。因此，通過內(nèi)部交叉驗(yàn)證的方法，結(jié)合各個(gè)參數(shù)，限制最大主因子數(shù)為11。校正樣本集的建模與預(yù)測情況見圖2、圖3。圖2為PRESS圖，該圖是模型選擇主因子的依據(jù)，當(dāng)PRESS值最小時(shí)對應(yīng)的主因子數(shù)，則為最優(yōu)模型所選擇的主因子數(shù)。圖3為校正樣本的預(yù)測值和真實(shí)值的對比圖，該圖顯示預(yù)測值和真實(shí)值的吻合程度。

圖2 PRESS圖Fig.2 Press figure

圖3 校正樣本化學(xué)值與預(yù)測值對比Fig.3 Contrast between chemical values and predicted values of calibration sample

好的模型應(yīng)有較高的相關(guān)系數(shù)和較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差。優(yōu)化后的校正模型見表1，從表1可知，模型的校正系數(shù)RC為0.98，校正標(biāo)準(zhǔn)差SEC為0.43，交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SECV為0.59，說明校正模型還是比較穩(wěn)定可靠的。

表1 校正模型結(jié)果Tab.1 The correction model results

3.3 校正模型的驗(yàn)證

校正模型建立后，用10個(gè)樣品(所備的60個(gè)樣品除50個(gè)用作校正集外的)采用外部驗(yàn)證法對所建模型預(yù)測效果進(jìn)行評價(jià)檢驗(yàn)。首先用已建的校正模型對10個(gè)樣品用近紅外光譜儀進(jìn)行掃描預(yù)測，用同樣的化學(xué)方法測定其粗蛋白的含量。將預(yù)測值與化學(xué)值進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

李延莉等用近紅外光譜法測定油菜籽蛋白質(zhì)時(shí)，絕對誤差介于0.45－2.75間，認(rèn)為這在油菜育種材料篩選過程中完全可以應(yīng)用［5］;趙環(huán)環(huán)等用傅立葉近紅外漫反射光譜法測定玉米粒中蛋白質(zhì)的含量，相對誤差介于0.121－11.898［6］。由上表可見，兩種研究方法測定值絕對誤差介于0.13－1.34，相對誤差介于0.63－6.42，平均絕對誤差0.72%，平均相對誤差3.54%，誤差較小。同時(shí)通過DPS7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性差異分析，在95%置信區(qū)間進(jìn)行真實(shí)值與預(yù)測值的多重比較，結(jié)果顯示不存在顯著性差異，說明兩種方法測定結(jié)果比較相近，該模型預(yù)測效果較好。

表2 凱氏定氮法化學(xué)值和近紅外光譜法預(yù)測值的結(jié)果對比(﹪)Tab.2 Comparison between values by Kjeldahl method and predicted values by near－infrared spectroscopy

3.4 散點(diǎn)圖

為了更好地說明苧麻粗蛋白含量的化學(xué)測定值與近紅外光譜模型預(yù)測值之間的相關(guān)性，以化學(xué)值為橫坐標(biāo)，預(yù)測值為縱坐標(biāo)，通過繪制化學(xué)值與預(yù)測值之間的散點(diǎn)圖來表明二者之間的相關(guān)性(圖4)，其相關(guān)方程為y=0.9319x+0.6596，相關(guān)系數(shù)為0.936。從圖4可見，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在直線及直線兩側(cè)，且偏離不大，說明了化學(xué)測定值與預(yù)測值之間具有良好的線性關(guān)系。

圖4 苧麻粗蛋白含量化學(xué)值與預(yù)測值之間相關(guān)圖Fig.4 The correlation of chemical values and predicted values of crude protein content in ramie

4 結(jié)語

該文應(yīng)用近紅外光譜儀建立了苧麻粗蛋白含量的預(yù)測模型，同時(shí)對模型進(jìn)行了驗(yàn)證。該模型具有較高的相關(guān)系數(shù)0.98，較低的校正集標(biāo)準(zhǔn)差0.43和交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差0.59，通過外部驗(yàn)證，化學(xué)值與預(yù)測值比較接近，二者之間具有較好的相關(guān)性，可知，應(yīng)用近紅外光譜法快速測定苧麻的粗蛋白含量是可行的。

通過研究為苧麻粗蛋白的定量分析提供了新的測試方法，具有環(huán)保、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以提高工作效率，對苧麻的育種和鑒定，品種篩選等具有指導(dǎo)作用。該研究中使用的樣品較少，所建的模型及結(jié)論的適用性還有待進(jìn)一步的檢驗(yàn)，在以后的應(yīng)用研究中應(yīng)該不斷擴(kuò)大樣本集，進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證模型。

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