GC/MS指紋圖譜結(jié)合Hotelling T 2檢驗用于香精品質(zhì)控制

劉秀明，王家俊，李源棟，夏建軍，田潤濤，者 為*

1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市北市區(qū)紅錦路367號 650231

2.科邁恩（北京）科技有限公司，北京海淀區(qū)信息路26號中關(guān)村創(chuàng)業(yè)大廈400室 100080

煙用香精主要用于增進卷煙嗅香和抽吸風(fēng)味等，由于其化學(xué)成分復(fù)雜，對其中一種或幾種化學(xué)成分進行定性定量分析，難以有效地控制其品質(zhì)［1］。目前，用于分析香精香料的儀器主要有近紅外光譜儀［2］、高效液相色譜儀（HPLC）［3］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）［4］等。由于香精一般均為揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分，GC/MS分析法較為廣泛采用。色譜指紋圖譜的應(yīng)用是一種有效的品質(zhì)控制方法，但在分析中，無論采用相關(guān)系數(shù)還是矢量夾角余弦來計算相似度，由于算法本身的問題，其對數(shù)據(jù)變化不敏感［5］，并且采用單一的某個方法很難對指紋圖譜提取物的成分及質(zhì)量分數(shù)進行總體評價；若采用化學(xué)計量學(xué)的方法，可對其品質(zhì)穩(wěn)定性進行適當(dāng)評價。主成分分析（Principal component analysis，PCA）是通過對一組相關(guān)變量進行正交旋轉(zhuǎn)等處理，用維數(shù)較少的互不相關(guān)的新變量來反映原變量提供的大部分信息，通過分析新變量達到解決問題的一種多元統(tǒng)計方法，已經(jīng)應(yīng)用在許多領(lǐng)域［6-10］。在香精香料品質(zhì)控制方面，文獻［8-9］采用GC/MS及PCA法分別建立了咖啡香精和煙用香精的指紋圖譜，進行品質(zhì)控制。Hotelling T2檢驗是一種常用多變量檢驗方法，是單變量檢驗的自然推廣，常用于兩組均向量的比較［11］。因此，將181個煙用香精樣品直接稀釋進樣，采集各個樣品的GC/MS指紋圖譜，采用PCA分析方法建立3類香精的分類模型，并設(shè)置95%置信限為控制線，99%置信限為預(yù)警線，提取3類香精的Hotelling T2統(tǒng)計量，實現(xiàn)對香精品質(zhì)的穩(wěn)定監(jiān)控，為香精品質(zhì)控制提供一種簡單、科學(xué)的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

紅云紅河煙草集團在用的不同批次不同風(fēng)格特征的成品香精共181個，均為液態(tài)。其中，A.“紅河（硬88）”用樣品54個，B.“紅河（硬99）”用樣品56個，C.“紅河（硬甲）”用樣品71個。

乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)（≥99%，美國Sigma-Aldrich公司）。

6890N/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），帶CIS4進樣口的TD-2熱解吸系統(tǒng)（德國Gerstel公司）；AB204-S電子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo公司）；SIMCA-p11.5+數(shù)據(jù)處理軟件（瑞典Umetrics公司）；ChemPattern化學(xué)計量學(xué)與化學(xué)指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件［1.0版，科邁恩（北京）科技有限公司］；有機相針式過濾頭（25 mm×0.45μm，昆明楚昊經(jīng)貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GC/MS分析

取約2 mL香精樣品，經(jīng)有機相濾膜過濾后進行GC/MS分析。分析條件為：

色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm）；載氣：高純氦（純度≥ 99.999%）；載氣流量：1 mL/min，恒流；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250 ℃；分流比：10∶1；分流流速：10 mL/min；范圍：29～445 amu；溶劑延遲：14.5 min。

1.2.2 指紋圖譜提取及化學(xué)計量學(xué)分析

采用ChemPattern軟件，對181個香精樣品的GC/MS指紋圖譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，確定其共有模式，然后從ChemPattern軟件中，將經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理及色譜峰保留時間校正對齊后的色譜數(shù)據(jù)（峰面積）導(dǎo)出至SIMCA-p11.5+，進行主成分分析，構(gòu)建3類香精的分類模型，通過提取Hotelling T2統(tǒng)計量，監(jiān)測香精總體品質(zhì)特性的穩(wěn)定性變化趨勢。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化及方法精密度

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

香精樣品中溶劑的量很高，為了消除不同種類溶劑的影響，可選擇較大分流比來減小溶劑的影響。然而分流比較大，歧視效應(yīng)也較大，影響香精樣品中一些重要的質(zhì)量分數(shù)較低化合物的檢測。在本實驗中，對3類香精樣品的分流比進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示10∶1的分流比效果較好。

考慮到香精樣品中的成分復(fù)雜，含有大量的低沸點組分，因此選擇較低的起始溫度；另外香精樣品成分的沸程跨度較大，為了達到快速分離的目的，選擇程序升溫來實現(xiàn)香精樣品中成分的分離。在本實驗中，對程序升溫的條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件如1.2.1節(jié)所示，既縮短了分析時間，峰形也較好。

2.1.2 方法的精密度

按照1.2節(jié)的預(yù)處理方法及色譜條件考察儀器精密度、日內(nèi)精密度和日間精密度。①儀器精密度：取1份香精樣品處理后連續(xù)進樣5次，計算共有色譜峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22個共有峰的相對峰面積的RSD均小于5%。②日內(nèi)精密度：取5份同一香精樣品，處理后于同一天內(nèi)分別進樣，計算共有色譜峰相對峰面積的RSD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一天內(nèi)測定的5個平行樣品相對峰面積的RSD均小于10%。③日間精密度：取同一個香精樣品，隔天測定1次，共測定5次，計算共有峰相對峰面積的RSD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隔天測定共5次的樣品共有色譜峰中，相對峰面積的RSD小于10%的峰占90%，其余峰的相對峰面積的RSD在10%～15%之間。以上結(jié)果表明儀器精密度較好，方法的日內(nèi)及日間精密度均滿足分析要求。相對峰面積RSD的最大值、最小值及平均值見表1。

2.2 香精的指紋圖譜提取

色譜指紋圖譜的提取不僅與色譜分離條件有關(guān)，還與軟件對色譜信息的提取有關(guān)，如何去除干擾，提取足夠的信息量對化學(xué)計量學(xué)分析非常重要。本研究中，采用邁恩公司的ChemPattern軟件，對香精樣品的GC/MS圖譜數(shù)據(jù)進行去背景、積分、剪裁、保留時間校正（對齊），以及色譜峰數(shù)據(jù)規(guī)范化處理等。

表1 方法的精密度考察（RSD，n=5） （%）

色譜峰保留時間的漂移現(xiàn)象屬于色譜實驗系統(tǒng)誤差和不確定性的一部分，在實驗中無法完全避免，當(dāng)待測組分非常復(fù)雜時，任何微小的時間飄移均會導(dǎo)致樣品間色譜峰匹配錯位而造成較大的計算偏差，因此確立色譜峰正確的對應(yīng)關(guān)系是順利進行化學(xué)計量學(xué)計算的先決條件。化學(xué)計量學(xué)針對色譜保留時間的校正提出了不少方法［12-13］。主要是利用加內(nèi)標(biāo)或者找出一些共同的標(biāo)志化合物進行校正，使目標(biāo)色譜指紋圖譜與待校準(zhǔn)的色譜指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)達到最大時進行校準(zhǔn)，當(dāng)化合物質(zhì)量分數(shù)差別較大時易出現(xiàn)錯誤匹配。ChemPattern軟件采用近鄰法［14］，基于特定的保留時間而非圖譜中具體的色譜峰，因此不受樣品圖譜中色譜峰是否發(fā)生變化的影響。圖1是其中一個樣品保留時間校正前后色譜峰匹配鏡像圖，圖2是保留時間校正前后總樣品色譜峰匹配示例圖。可以看出，經(jīng)過手動及自動調(diào)整，能夠正確地解決峰的保留時間漂移和重疊峰的問題。圖3為經(jīng)預(yù)處理后部分3類香精樣品的GC/MS指紋圖譜。

2.3 主成分數(shù)的選擇與PCA分類模型的建立

應(yīng)用SIMCA-p11.5+軟件中PCA方法，結(jié)合A、B、C 3類香精的GC/MS指紋圖譜，分別建立主成分分類模型，并提取相應(yīng)的Hotelling T2統(tǒng)計量作為監(jiān)測香精品質(zhì)狀態(tài)的統(tǒng)計量。在PCA分析過程中，選擇適宜主成分數(shù)時，主成分特征值（Eigenvalues）一般需要大于2，同時應(yīng)兼顧主成分分析對原色譜數(shù)據(jù)的累積解釋能力和模型的預(yù)測精度。主成分分析對色譜數(shù)據(jù)矩陣?yán)塾嫿忉屇芰Γ≧2Xcum）值越接近1，對模型的解釋能力越好；模型預(yù)測精度可通過累計交叉有效性來反映［15］。

分析A、B類香精，當(dāng)主成分數(shù)增到4時，新增加的第四主成分對提升模型預(yù)測精度的貢獻不顯著，所以A、B類香精類模型的適宜主成分數(shù)應(yīng)為3。同理C類香精類模型的適宜主成分數(shù)應(yīng)為2。選用不同主成分數(shù)時，PCA分類模型的特征值、R2Xcum、Q2和Q2cum見表2。圖4為3類香精的第一、第二主成分得分 t［1］/t［2］分布示意圖。從圖 4 可知，在95%的置信范圍內(nèi)，131個香精樣品明顯分為3類。

2.4 PCA分類模型的應(yīng)用

分別對A、B、C 3類香精50個樣品進行Hotelling T2統(tǒng)計量監(jiān)測驗證，驗證結(jié)果見表3。設(shè)置95%置信限為控制線，99%置信限為預(yù)警線，A、B類香精的驗證樣品均得到正確預(yù)測。以C類香精為例，圖5為C類香精以PCA分類模型建立的Hotelling T2統(tǒng)計量監(jiān)測示意圖，可用來衡量樣本到主成分空間原點的距離，從而評估被監(jiān)測樣品色譜的離散程度。

表2 A、B和C 3類香精PCA類模型的相關(guān)統(tǒng)計量

表3 3類香精的Hotelling T 2統(tǒng)計量驗證結(jié)果

由圖5可知，C類香精20個驗證樣品中大部分的Hotelling T2統(tǒng)計量均在95%（Hotelling T2=6.35）置信范圍內(nèi)波動，其中配方錯誤的68#、69#、70#3個樣品超出了控制線95%（Hotelling T2=6.35），被人為錯誤歸類的60#樣品超出了預(yù)警線99%（Hotelling T2=9.99），該結(jié)果與68#、69#、70#、60#4個香精樣品的相對密度（d2020）及折光指數(shù)（nD20）檢測值異常情況（相對偏差絕對值均大于10%）一致，C類香精4個樣品的相對密度及折光指數(shù)結(jié)果見表4。結(jié)果表明：以Hotelling T2統(tǒng)計量的99%置信限作為品質(zhì)控制限，95%置信限作為品質(zhì)預(yù)警限，建立的分類模型能正確預(yù)測C類香精的品質(zhì)波動。

表4 4個香精樣品的相對密度及折光指數(shù)

3 結(jié)論

①GC/MS指紋圖譜結(jié)合Hotelling T2統(tǒng)計量建立的香精主成分分類模型，能準(zhǔn)確預(yù)測香精品質(zhì)的波動情況。②本方法可配合常規(guī)技術(shù)對香精整體品質(zhì)的穩(wěn)定性進行監(jiān)測。

［1］ 王鈞，趙曰利.浙大中藥指紋圖譜相似度計算軟件在煙用香精香料色譜分析中的引入應(yīng)用［J］.現(xiàn)代儀器，2007，13（3）：47-49.

［2］ 王家俊，邱啟楊，劉巍.FTIR-ATR指紋圖譜的主成分分析-馬氏距離法應(yīng)用于煙用香精質(zhì)量的控制［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（5）：895-898.

［3］ 田海英，宋金勇，王宏偉.RP-HPLC法測定煙用香精香料中的7種防腐劑［J］.煙草科技，2011（2）：47-5l.

［4］ 張艷芳，鮑峰偉，陳偉華，等.煙用香精香料的GC/MS指紋圖譜［J］.煙草科技，2014（7）：60-63，84.

［5］ 包錦淵，吳啟勛.青海秦艽色譜指紋圖譜的灰色關(guān)聯(lián)分析［J］.上海大學(xué)學(xué)報，2006，12（6）：620-623．

［6］ SONG Shiqing，ZHANG Xiaoming，Hayatc K，et al.Coordinating fingerprint determination of solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry and chemometric methods for quality control of oxidized tallow［J］.Journal of Chromatography A，2013，1278：145-152.

［7］ CHEN Yi， ZHU Shangbin， XIE Mingyong， et al.Quality control and original discrimination of Ganodermalucidum based on high-performance liquid chromatographic fingerprints and combined chemometricsmethods［J］.Analytica Chimica Acta，2008，623（2）：146-156.

［8］ 鐘科軍，魏萬之，郭方遒，等.GC-MS及主成分分析法用于咖啡香精的指紋圖譜分析和微差樣品的識別［J］.分析試驗室，2006，25（8）：119-122.

［9］ 郭紫明，董道竹，李燕春，等.氣相色譜-質(zhì)譜法和主成分投影分析法用于煙用香精的分析和質(zhì)量控制［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2008，44（1）：22-27.

［10］黃世杰，許藹飛，王維剛.主成分分析法在煙用香精質(zhì)量控制中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14537-14538.

［11］莫惠棟.農(nóng)業(yè)試驗統(tǒng)計［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1992：467-509.

［12］蔡澤凡，朱學(xué)峰，賴何季，等.基于小波變換的HPLC指紋圖譜基線漂移的校正［J］.山東大學(xué)學(xué)報：工學(xué)版，2005，35（增刊）：140-142.

［13］Bortolato S A，Arancibia J A，Escandar G M，et al.Time-alignment of bidimensional chromatograms in the presence of uncalibrated interferences using parallel factor analysis application to multi-component determinations using liquid-chromatography with spectrofluorimetric detection［J］.Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，2010，101（1）：30-37.

［14］李文杰，李文明.基于k-近鄰算法的定位方法設(shè)計和仿真對色譜峰進行歸屬［J］.計算機仿真，2009，26（4）：194-196，351.

［15］李偉，馮洪濤，周桂圓，等.Hotelling T2結(jié)合多組分NIR校正模型在卷煙生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)測中的應(yīng)用［J］.煙草科技，2014（7）：5-9.