改良酸性土壤對(duì)川芎藥用質(zhì)量的影響

寧梓君 李 彬 李春苗 何春楊 夏厚林 陳 幸▲

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，成都 611130；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥學(xué)研究所，成都 610041

川芎來源于傘形科藁本屬植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，為我國(guó)四川省的道地藥材，主產(chǎn)于四川省彭州市和都江堰市。川芎入肝、膽、心包經(jīng)，有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效，可用于治療胸痹心痛、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕痹痛等[1]。現(xiàn)有研究表明，川芎植物有富集土壤中鎘的能力[2-3]。鎘是一種劇毒的重金屬元素，通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)肝、腎、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等造成一系列損害，鎘過量會(huì)使組織代謝系統(tǒng)發(fā)生障礙以及抑制多種酶的活性，可引發(fā)骨痛病、肺水腫等多種疾病[4-5]。川芎對(duì)鎘的富集能力嚴(yán)重影響了川芎的質(zhì)量和藥用價(jià)值，威脅服用者的用藥安全，近年來川芎的鎘含量超標(biāo)，已經(jīng)成為阻礙其對(duì)外出口的主要因素。對(duì)此，本課題組對(duì)四川省彭州市川芎種植基地進(jìn)行了長(zhǎng)期研究調(diào)查，發(fā)現(xiàn)川芎中的鎘主要來源于其栽培土壤，并且鎘含量隨土壤酸度的增大而增加[6-7]。因此改良酸性土壤，提高土壤pH值是降低川芎鎘含量的關(guān)鍵。

目前對(duì)于中、輕度鎘污染的酸性土壤，施入生石灰是投入低、效率高的改良方法[8]。由于川芎是藥用植物，故本研究按照2010版《藥典》規(guī)定的川芎項(xiàng)下方法對(duì)施用生石灰后收獲期的川芎質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為后期研究工作提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 供試樣品

本實(shí)驗(yàn)的川芎樣品均取自四川省敖平鎮(zhèn)川芎種植基地。

1.2 主要試劑

甲醇（分析純：成都長(zhǎng)聯(lián)化工試劑有限公司；色譜純：Fisher Scientific），甲苯（優(yōu)級(jí)純，成都長(zhǎng)聯(lián)化工試劑有限公司），冰醋酸（優(yōu)級(jí)純，成都市科龍化工試劑廠），阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0773-9708），鹽酸（優(yōu)級(jí)純，成都金山化學(xué)試劑有限公司），硝酸銀（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

1.3 主要儀器

電子恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Waters e2659高效液相色譜儀（美國(guó)）配Waters 2486檢測(cè)器（美國(guó)），JA2003N型電子天平（1/1萬，上海精密科學(xué)儀器有限公司），AUW220D型電子天平（1/10 萬，島津公司），Millipore超純水機(jī)（美國(guó)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 田間處理及樣品采集

于彭州市敖平鎮(zhèn)選取一塊典型的酸性川芎栽培土壤作為實(shí)驗(yàn)用地，總面積約230 m2。本研究設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：1個(gè)空白組和3個(gè)處理組，分別標(biāo)記為PCK、P1、P2和P3。在川芎栽種前，將實(shí)驗(yàn)用地分為4等塊，向各地塊均勻撒入生石灰，施用量分別為PCK：0 kg/hm2；P1：750 kg/hm2；P2：1125 kg/hm2；P3：1500 kg/hm2。 施撒后翻地混勻。于川芎收獲期，在各地塊內(nèi)以“S”形線路隨機(jī)取5點(diǎn)，采集川芎全株，自然風(fēng)干，去除地上部分以及沙礫、須根等異物，切片，干燥、粉碎，得到川芎供試品。

2.2 檢查

2.2.1 水分

精密稱取藥材粉末（過二號(hào)篩）12 g，置圓底燒瓶中，加甲苯約200 ml，并加入干燥、潔凈的沸石數(shù)粒。圓底燒瓶依次連接水分測(cè)定管以及冷凝管。自冷凝管頂端加入甲苯，至充滿水分測(cè)定管狹細(xì)部分。將圓底燒瓶置電熱套中緩慢加熱，待甲苯開始沸騰時(shí)，調(diào)節(jié)溫度，使每秒鐘餾出2滴。待測(cè)定管刻度部分的水量不再增加時(shí)，將冷凝管內(nèi)部用甲苯?jīng)_洗，再用飽蘸甲苯的長(zhǎng)刷將管壁上附著的甲苯推下，繼續(xù)蒸餾5 min，放冷至室溫，拆卸裝置，放置，待水與甲苯完全分離。檢讀水量，計(jì)算含水量（%）。

2.2.2 總灰分與酸不溶灰分

精密稱取藥材粉末（過二號(hào)篩）4 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量。緩緩熾熱至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至600℃，使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算川芎供試品中總灰分含量（%）。取以上灰分，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 ml，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 ml沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥熾灼至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算川芎供試品中酸不溶性灰分的含量（%）。

2.3 浸出物

取藥材粉末（過四號(hào)篩）3 g，精密稱定，置100 ml的錐形瓶中，精密加70%乙醇50 ml，密塞，稱定重量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 ml，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。以干燥品計(jì)算川芎供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。

2.4 阿魏酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

WatersSymmetry C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-1%醋酸溶液（20∶80），檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μl。該色譜條件下，樣品中阿魏酸與其他成分達(dá)到基線分離。對(duì)照品及川芎樣品的高效液相色譜圖如圖1。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備

取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱取20 mg，置100 ml棕色量瓶中，用70%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1 ml，置10 ml棕色量瓶中，用70%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備

取藥材粉末（過四號(hào)篩）適量，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 方法學(xué)考查

圖1 阿魏酸對(duì)照品（A）與川芎樣品（B）的HPLC色譜圖1.阿魏酸

2.4.4.1 線性及范圍考查 精密吸取對(duì)照品溶液3、5、10、15、20 μl，注入 HPLC 色譜儀。以峰面積（A）對(duì)分析物質(zhì)量濃度（C）做線性回歸，如圖2，結(jié)果表明阿魏酸在0.062~0.411μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖2 阿魏酸對(duì)照品峰面積及線性關(guān)系圖1.阿魏酸

2.4.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μl，注入HPLC色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算對(duì)照品中阿魏酸峰面積的RSD為0.61%。

2.4.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取編號(hào)為PCK的川芎藥材粉末6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，計(jì)算供試品中阿魏酸峰面積的RSD為1.25%。

2.4.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣 10 μl，計(jì)算供試品中阿魏酸峰面積的RSD為0.78%。

2.4.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知阿魏酸含量的川芎藥材粉末適量，精密稱取0.2 g，共6份，置具塞錐形瓶中。分別加入阿魏酸對(duì)照品5 ml后，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果見表1，計(jì)算回收率?；厥章剩?）=（加樣后測(cè)得量-樣品中阿魏酸量）/加樣量×100%。

表1 加樣回收試驗(yàn)

2.5 測(cè)定結(jié)果

按照以上方法對(duì)川芎樣品各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 川芎樣品各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表2可知，各組川芎樣品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合《藥典》（2010版）川芎項(xiàng)下限量要求。相對(duì)于PCK組，各處理組的含水量及酸不溶灰分含量有一定的升高，總灰分含量降低，浸出物及阿魏酸含量升高。P1、P2、P3組浸出物含量分別升高12.15%、7.99%、10.07%，阿魏酸含量分別升高0.88%、3.95%、21.93%，各組阿魏酸含量隨生石灰的施用量增大而升高。升高量（%）=（處理組測(cè)得量-PCK組測(cè)得量）/PCK組測(cè)得量×100%。

3 討論

3.1 測(cè)定川芎各指標(biāo)的方法

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《藥典》（2010版）川芎項(xiàng)下方法對(duì)川芎樣品的水分、灰分、浸出物和阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定和分析，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好。川芎中化學(xué)成分較復(fù)雜，其中阿魏酸、川芎嗪和藁本內(nèi)酯是公認(rèn)的主要藥效成分[9]，但由于川芎嗪含量太低，僅占生藥量的0.01%~0.02%，且具有升華性，藁本內(nèi)酯不穩(wěn)定，可發(fā)生脫氫、氧化、水解、降解等異構(gòu)化反應(yīng)[10-11]，所以本實(shí)驗(yàn)參照《藥典》（2010版）要求以阿魏酸含量作為評(píng)價(jià)川芎藥用質(zhì)量的參考指標(biāo)。

3.2 生石灰對(duì)川芎質(zhì)量的影響

由以上測(cè)定結(jié)果可知，施用生石灰后，川芎藥材質(zhì)量符合《藥典》（2010版）中川芎項(xiàng)下限量要求，且浸出物及阿魏酸含量升高。相對(duì)于PCK組，處理組的含水量及灰分含量有一定的變化，但均低于 《藥典》（2010版）中的限量要求，故可認(rèn)為此變化未對(duì)川芎的藥用質(zhì)量造成影響。已有研究表明，施用石灰可降低土壤中重金屬活性，增加土壤對(duì)重金屬的吸附作用，同時(shí)還具有改善土壤結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分，促進(jìn)作物的生長(zhǎng)的功能[12-14]。川芎浸出物及阿魏酸含量升高，可能與生石灰促進(jìn)川芎生長(zhǎng)，使其根莖生物量增加有關(guān)。結(jié)果提示，施用生石灰對(duì)川芎藥材質(zhì)量無不良影響，生石灰可用于改良酸性的川芎栽培土壤。

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