竹筍殼生物轉(zhuǎn)化木糖醇高產(chǎn)菌株的篩選

祝燕燕，陳顯群，楊勝利

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.溫州市食品研究所，浙江 溫州 325000）

木糖醇是一種五碳糖醇，甜度與蔗糖相當，同時木糖醇具有較寬的酸pH范圍，玻璃化所需溫度較低，具有較長時間的儲藏和保存的較優(yōu)性能[1]。木糖醇是所有食用糖醇中生理活性最好的品種，作為一種高效的功能性營養(yǎng)添加劑，它味甜低熱，口感清涼，發(fā)熱與葡萄糖等同[2]。根據(jù)文獻報道，目前工業(yè)化生產(chǎn)低熱量、無糖的多元醇甜味劑的需求正在與日俱增，其中木糖醇就是一種重要的替代品，具有優(yōu)良的生理功能和廣泛的應(yīng)用價值[3]。

傳統(tǒng)的木糖醇生產(chǎn)方法是采用化學(xué)催化加氫法，該法生產(chǎn)成本高，對環(huán)境污染嚴重[4]。生物轉(zhuǎn)化法一直被認為是一條更為經(jīng)濟的工藝路線，因為發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇無需木糖純化步驟，還可以簡化木糖醇的分離過程[5]。我國竹類資源十分豐富，全國毛竹林約為240萬公頃。目前竹筍殼一般沒有利用價值，農(nóng)民都是任其腐爛。其實竹筍殼富含豐富的半纖維素，其含量為28.12%[6]，用其生產(chǎn)木糖乃至木糖醇將是很好的原料，成本低廉?；谥窆S殼的成分和生物轉(zhuǎn)化法的特點，我們以竹筍殼水解液作為木糖來源發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇。

1 材料

1.1 菌種

土樣來自浙江工業(yè)大學(xué)小竹林。用無菌小鏟子除去表面的土壤，選取離地面5～15 cm處的土壤，小心放入清潔干凈的樣品袋中，密封好，記錄采樣的時間、地點以及環(huán)境條件。

挑取出現(xiàn)發(fā)霉狀況的竹筍殼，將其放入粉碎機中粉碎，將碎粒小心放入清潔干凈的樣品袋中，密封好。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：D-木糖 20，酵母膏 5，磷酸二氫鉀2，二水氯化鈣0.1，七水硫酸鎂 0.2，硫酸銨 5，瓊脂 20。

菌種保藏培養(yǎng)基（g/L）：D-木糖 20，酵母膏 5，磷酸二氫鉀2，二水氯化鈣0.1，七水硫酸鎂0.2，硫酸銨5，瓊脂20。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：竹筍殼水解液（木糖含量20），蛋白胨 10，酵母粉 10。

滅菌條件：木糖與其他營養(yǎng)成分分開滅菌，條件為121℃，20 min。

1.3 菌種的分離純化

取土樣5 g溶于適量的無菌水中進行攪拌，之后取上清液按照稀釋法進行適當?shù)南♂專魅∠♂屘荻葹?10-1、10-2、10-3、10-4 、10-5、10-6、l0-7的稀釋液0.1 mL分別涂布于細菌選擇性培養(yǎng)基中。每個稀釋濃度涂3個平板以上，然后將平板放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，之后觀察菌落的形態(tài)和大小，從平板上挑選長得好的大的菌落，進行平板劃線分離后再接入斜面進行菌種保藏和初篩分析用。

1.4 菌種的擴大培養(yǎng)

分離純化得到的優(yōu)勢菌株，取適量接種于含有100 mL種子培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，平行接種3瓶種子液。在30℃、200 r/min的培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)2～3 d，根據(jù)微生物生長狀況適時終止培養(yǎng)，選取長勢良好且澄清透明的發(fā)酵液作為種子發(fā)酵液。

2 方法

2.1 竹筍殼水解液的制備

（1）竹筍殼：來自浙江工業(yè)大學(xué)北門菜市場，將竹筍殼清洗烘干后，用電動粉碎器粉碎，粉碎粒度100目，半纖維素質(zhì)量分數(shù)為28%。

（2）竹筍殼半纖維素水解：竹筍殼粉末以1:8（質(zhì)量：體積）的固液比與質(zhì)量濃度1.0%硫酸混合，121℃下水解1 h。

（3）真空濃縮：水解液離心濾去竹筍殼殘渣后，50℃真空濃縮至總還原糖為20%左右。

（4）中和：水解液用固體NaOH過中和至pH 10.0，4500 r/min離心20 min去除沉淀。上清液用濃硫酸回調(diào)至pH 5.5。冷藏備用。

2.2 水解液的發(fā)酵

在250 mL錐形瓶中加入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將液體種子以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min。30℃發(fā)酵48 h后停止搖動，最后進行24 h的木糖醇積累。

2.3 測定方法

2.3.1 木糖濃度測定

取待測品 10 mL，2500 r/min離心 10 min，將上清液適當稀釋。在25 mL試管中加入1 mL稀釋的上清液于大試管中，加入3 mL的DNS試劑，混勻后在沸水浴中反應(yīng)5 min，冷卻，定容25 mL。在波長540 nm處測量吸光度值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算出樣品糖濃度[7]。

2.3.2 木糖醇含量測定

用紫外可見分光光度計法來測定木糖醇的含量。

試劑的配置：試劑a：將0.320 g高碘酸鉀溶于100 mL 1%的鹽酸中。

試劑b：配置鼠李糖1.11 g/L。

NaSH試劑（需現(xiàn)配現(xiàn)用）：在100 mL 150 g/L的乙酸銨中，分別加入0.2 mL的乙酸及乙酰丙酮。

取適量發(fā)酵液，4500 r/min離心15 min，將上清液適當稀釋。取1 mL稀釋液于小試管中，加入1 mL的試劑a，混勻后在室溫下反應(yīng)10 min，再分別加入2 mL的試劑b和4 mL的NaSH試劑，混合均勻后在53℃水浴中保溫15 min，冷卻后于412 nm處測定吸光度值[8]。

2.3.3 轉(zhuǎn)化率計算

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種生長情況

圖1是部分菌種劃線分離后生長情況。它們是從不同濃度的進行平板涂布的培養(yǎng)基上挑選出來的，長得較大的較好的單菌落。在超凈工作臺上，將這些單菌落挑選出來，進行劃線分離，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。最后在超凈工作臺上，將以上分離出來的單菌落接到斜面試管中進行菌種的保藏，以備后續(xù)試驗。

圖1 菌種的生長情況Fig 1 The growth situation of strain

3.2 木糖標準曲線

圖2 木糖標準曲線Fig 2 Standard curve of xylose

3.3 木糖醇標準曲線

圖3 木糖醇標準曲線Fig3 Standard curve of xylitol

3.4 篩選結(jié)果

初始培養(yǎng)基的木糖濃度均為20 mg/mL。

發(fā)酵液中的木糖醇含量根據(jù)木糖醇標準曲線方程式計算，并乘以稀釋倍數(shù)。

表2 工業(yè)應(yīng)用試驗數(shù)據(jù)表

不同菌種發(fā)酵所得到的木糖轉(zhuǎn)化率如表1所示。從表中可以看出，這30個菌株的轉(zhuǎn)化能力各不相同，在取平均值之后，可以看到轉(zhuǎn)化率高的菌株能夠達到46.3%，而轉(zhuǎn)化率低的只有23.1%。用自然篩選得到的菌株差異較大，并且為了獲得高轉(zhuǎn)化率的菌株需要進行大量的實驗積累數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

從發(fā)霉竹筍殼及特定土樣出發(fā)，以竹筍殼水解液為唯一碳源，通過篩選培養(yǎng)基篩選出了能利用木糖生產(chǎn)木糖醇的30株菌株，并通過搖瓶培養(yǎng)后比較木糖轉(zhuǎn)化率得到了高產(chǎn)木糖醇菌株即第3號菌株，其木糖轉(zhuǎn)化率達到46.3%。對竹筍殼的廢物利用，綠色環(huán)保，并有利于增加農(nóng)民收入，對其發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇可進行后續(xù)研究。

[1]張鳳，張麗君，周長民.木糖醇的特性及應(yīng)用[J].當代化工， 2008， 37（2）:92-95.

[2]M覿kinen K K.Xylitol and oral health[J].Adv.Food Res，1979，25:137-180.

[3]Swati M.Comparative study on different strategies involved for xylitol purification from culture media fermented by Candida tropicali[J].Separation and Purification Technology， 2011， 78（3）:266-273.

[4]王關(guān)斌，趙光輝.木糖醇的生產(chǎn)與發(fā)展趨勢[J].浙江化工，2005，36（2）:25-26.

[5]趙壽經(jīng)，候琨，梁彥龍，等.產(chǎn)木糖醇菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].吉林大學(xué)學(xué)報（工學(xué)版），2010，40（3）：868-872.

[6]周曉潔，李建強，陳延興.竹筍殼化學(xué)成分分析[J].武漢科技學(xué)院學(xué)報，2010，23 （1）:1-3.

[7]王旭，蘇桂峰.假絲酵母發(fā)酵玉米芯半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇[J].China Brewing， 2009（6）:42-45.

[8]張曉元，王松梅，朱希強，等.熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的研究[J].食品與藥品，2006，8（11）:27-30.