鳥分枝桿菌復合群藥物敏感性試驗結果及臨床特征分析

李燕明 佟訓靚 逄宇 王玉峰 宋媛媛 趙雁林

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·論著·

鳥分枝桿菌復合群藥物敏感性試驗結果及臨床特征分析

李燕明 佟訓靚 逄宇 王玉峰 宋媛媛 趙雁林

目的 分析鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌感染的風險因素及耐藥譜差別，為治療鳥分枝桿菌復合群提供科學依據(jù)。方法 選取2011—2013年來自4家結核病?？漆t(yī)院6121例疑似肺結核患者中，分離的非結核分枝桿菌菌株452株為研究對象。通過多靶位基因測序法對上述菌株進行鑒定，選取其中鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌，使用最低抑菌濃度法(MIC)評估鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌對12種抗生素的藥物敏感性試驗結果的差別。此外，分析兩種菌種感染在不同社會人群及臨床特征中的分布。采用SPSS 14.0軟件對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的全部藥物的耐藥率，以及兩種鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌肺病患者人口學信息及臨床癥狀比率進行卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果 在452株非結核分枝桿菌中，胞內分枝桿菌為最主要的非結核分枝桿菌，總計188株，占41.6%。胞內分枝桿菌對莫西沙星和利奈唑胺的耐藥率分別為1.6%(3/188)和8.5%(16/188)；鳥分枝桿菌對莫西沙星和利奈唑胺的耐藥率分別為10.8%(7/65)和40.0%(26/65), 差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為10.71、44.71；P值均<0.05)。鳥分枝桿菌對利福平的耐藥率為38.5%(25/65)，低于胞內分枝桿菌對利福平的耐藥率66.0%(124/188)(χ2=9.01，P<0.05)。 在胞內分枝桿菌肺病患者中，超過65歲的老年人占41.5%(78/188)，慢性阻塞性肺病的患者占52.1%(98/188)；鳥分枝桿菌肺病患者中超過65歲的老年人占23.1%(15/65)，慢性阻塞性肺病的患者占27.7%(18/65)(OR=2.36，95%CI: 1.25～4.46,P<0.05；OR=2.84，95%CI: 1.56～5.19,P<0.05)。結論 胞內分枝桿菌是目前最常見的非結核分枝桿菌，且胞內分枝桿菌與鳥分枝桿菌的耐藥譜有明顯差別。臨床胞內分枝桿菌肺病更易于發(fā)生在老年患者及具有慢性阻塞性肺病的患者中。

鳥復合分枝桿菌； 微生物敏感性試驗

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是分枝桿菌屬內除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的統(tǒng)稱[1]。通常認為非結核分枝桿菌為條件致病菌，其中某些菌可以引起肺部、淋巴結、皮膚組織等感染[1]。近些年來，流行病學數(shù)據(jù)表明全世界范圍內由非結核分枝桿菌引起的肺病呈現(xiàn)上升的趨勢[2]。中國是世界結核病高負擔國家之一，但是據(jù)2000年和2010年進行的全國結核病流行病學調查結果表明，非結核分枝桿菌的分離率由11.1%上升為22.9%[3]。因此，非結核分枝桿菌同樣是我國面臨的一個重大的公共衛(wèi)生問題。

在所有非結核分枝桿菌種類中，鳥分枝桿菌復合群是最為常見的致病菌[4]。它主要包括鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌兩種，雖然這兩種細菌通過傳統(tǒng)的生化檢驗方法不能加以區(qū)分，但是它們在致病性和其他生物學特性方面表現(xiàn)出較大的差別[5]。有研究表明，鳥分枝桿菌容易感染艾滋病患者，而胞內分枝桿菌更易于使非HIV感染患者致病[5]。此外，與鳥分枝桿菌引起的肺病相比，胞內分枝桿菌引起的肺病癥狀更嚴重而且預后更不理想[6]。對不同抗生素的耐藥性是鳥分枝桿菌復合群的一個重要基礎性數(shù)據(jù)，同時對于指導患者開展有針對性治療具有重要意義，然而對于鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌進行藥物敏感性試驗所得結果的數(shù)據(jù)較少。因此，對鳥分枝桿菌復合群進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗及臨床數(shù)據(jù)的回顧性分析，對于全面理解兩種分枝桿菌的生物學特征具有重要意義。

材料和方法

一、患者與菌株來源及其一般資料

本研究共收集2011—2013年來自廣州市胸科醫(yī)院、連云港市第四人民醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院和開封市肺科醫(yī)院4家結核病?？漆t(yī)院的6121例疑似肺結核患者，從其中分離非結核分枝桿菌菌株452株為研究對象。

二、菌種的分離與鑒定

利用對硝基苯甲酸生長實驗和噻吩-2-羧酸肼生長實驗對分枝桿菌菌種進行鑒定。培養(yǎng)基內藥物濃度為: 對硝基苯甲酸500 mg/ml、噻吩-2-羧酸肼5 mg/ml。其中兩種培養(yǎng)基上均生長者則可初步判定為非結核分枝桿菌[7]。

傳統(tǒng)生化方法鑒定獲得的452株非結核分枝桿菌菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；快速生長的分枝桿菌培養(yǎng)1周，慢緩生長的分枝桿菌培養(yǎng)4周，分別刮取培養(yǎng)基斜面上的菌落收集于三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA，TE)緩沖液中，采用水煮法提取基因組DNA[8]。 采用多靶位基因測序法對上述菌株進行鑒定，包括16S rRNA,hsp65,rpoB和16S～23S rRNA間隔區(qū)，引物序列參見表1。以提取的基因組DNA作為模板，按照如下配置50 μl反應體系：5 μl 10×PCR緩沖液，200 μmol 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)， 0.2 μmol的引物, 1 U HotStar Taq聚合酶(Qiagen)；將配置好的體系置于PCR儀，擴增條件如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送北京擎科生物技術有限公司進行測序，測序結果與美國國家生物技術信息(National Center for Biotechnology Information, NCBI)中的序列進行比對，從而完成菌種鑒定。

表1 本研究中用于菌種鑒定的引物序列

注 表中括號內F表示為正向引物；R表示為反向引物

三、藥物敏感性試驗

采用美國臨床和實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微孔板稀釋法進行[9]。配置調整陽離子的米勒-希爾頓(Mueller-Hinton， MH)液體培養(yǎng)基，在使用前向其中添加5%的增菌劑。首先制備0.5麥氏濃度的菌懸液，并將上述50 μl菌懸液加入到10 ml培養(yǎng)基中稀釋，在配置好的含藥培養(yǎng)基中每孔添加100 μl。根據(jù)臨床和實驗室標準委員會的推薦及文獻報道，總計選擇12種抗生素：克拉霉素、阿奇霉素、利福平、利福布汀、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、利奈唑胺、阿米卡星和卷曲霉素。藥物的濃度范圍為0.0625～128 μg/ml，不同藥物的臨界濃度見表2。

表2 不同藥物的臨界濃度

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 14.0軟件對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的耐藥率，以及兩種鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌肺病患者人口學信息及臨床癥狀比率進行卡方檢驗，當P<0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同分枝桿菌菌種的構成情況

本研究總計選取生化初篩鑒定獲得的452株非結核分枝桿菌進行菌種鑒定，分析結果表明鳥分枝桿菌復合群是最主要的非結核分枝桿菌，總計253株，占56.0%；其中胞內分枝桿菌188株(41.6%)和鳥分枝桿菌65株(14.4%)。其次是龜-膿腫分枝桿菌復合群，有103株，占22.8%，其中最主要的為膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌，分別有75株(16.5%)和25株(5.5%)。此外，還發(fā)現(xiàn)堪薩斯分枝桿菌24株(5.3%)、偶然分枝桿菌21株(4.6%)、戈登分枝桿菌19株(4.2%)、龜分枝桿菌3株(0.7%)及其他分枝桿菌32株(7.1%)。選取253株鳥胞內分枝桿菌復合群進行后續(xù)分析。

二、鳥分枝桿菌復合群的藥物敏感性試驗結果

克拉霉素、卷曲霉素和利福布汀表現(xiàn)出對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌有很好的抗菌活性，其中克拉霉素對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌能抑制50%菌株生長的最低抑菌濃度(MIC50)和能抑制90%菌株生長的最低抑菌濃度(MIC90)分別為0.5 μg/ml和2.0 μg/ml，其耐藥率分別為3.0%和2.1%。鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌對利福布汀的耐藥率分別為1.7%和2.7%。而阿奇霉素、左氧氟沙星、加替沙星和鏈霉素對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的抗菌效果較差，其耐藥率均高于70%(表3)。

表3 12種抗生素對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的耐藥譜

此外，莫西沙星和利奈唑胺及利福平表現(xiàn)出對兩種分枝桿菌不同的抗菌活性；其中，鳥分枝桿菌對莫西沙星的耐藥率(10.8%)顯著高于胞內分枝桿菌(1.6%)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.71，P<0.05)；與之類似，有40.0%的鳥分枝桿菌對利奈唑胺耐藥，顯著高于胞內分枝桿菌的耐藥率(8.5%)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=44.71，P<0.05);與上述兩種藥物相反，胞內分枝桿菌(66.0%)比鳥分枝桿菌(38.5%)表現(xiàn)出對利福平有更高的耐藥率，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.01，P<0.05)。

三、鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌感染的社會人口學及臨床癥狀特征分析

在胞內分枝桿菌肺病患者中，年齡≥65歲患者的比率(41.5%)顯著高于鳥分枝桿菌肺病患者 (23.1%)(OR=2.36，95%CI: 1.25～4.46,P=0.008)，而兩組其他社會人口學特征進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義。對比兩組患者不同合并癥的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)胞內分枝桿菌肺病患者伴發(fā)慢性阻塞性肺病者顯著高于鳥分枝桿菌肺病患者 (OR=2.84，95%CI: 1.56～5.19,P=0.001)，提示慢性阻塞性肺病可能是胞內分枝桿菌肺病的高風險因素。此外，兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(表4)。

討 論

非結核分枝桿菌肺病日益增多，在美國、韓國和日本，鳥分枝桿菌復合群是最常見的非結核分枝桿菌，而在英格蘭堪薩斯分枝桿菌最為普遍[10-13]。在中

表4 不同社會人口及臨床特征的患者在鳥分枝桿菌與胞內分枝桿菌病中的比較

注 “-”代表此處無意義

國不同地區(qū)開展的研究表明，鳥分枝桿菌復合群是最主要引起非結核分枝桿菌肺病的病原菌[14-15]，本研究也表明鳥分枝桿菌復合群是我國主要流行的非結核分枝桿菌，其中，胞內分枝桿菌為優(yōu)勢菌種，占全部非結核分枝桿菌的41.6%。有研究表明鳥分枝桿菌感染主要發(fā)現(xiàn)于CD4 T淋巴細胞嚴重缺損的HIV感染患者中[16]，因為我國HIV感染的低流行率可能與鳥分枝桿菌分離比例較低相關。

由于相似的生化特征，胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌通常在臨床工作中很難區(qū)分[5]。本研究表明，胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌在藥物敏感性試驗結果中差異有統(tǒng)計學意義。其中，鳥分枝桿菌對莫西沙星和利奈唑胺的耐藥率顯著高于胞內分枝桿菌，而胞內分枝桿菌較鳥分枝桿菌有更高的對利福平的耐藥率。與本研究結果不同，Guthertz 等[16]報道胞內分枝桿菌較鳥分枝桿菌對利福平更敏感。而Maesaki等[17]的研究結果顯示，采用固體培養(yǎng)基的方法胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌對利福平的耐藥率差異無統(tǒng)計學意義。與本研究結果類似，段鴻飛等[4]發(fā)現(xiàn)鳥分枝桿菌對利福平的MIC50(16 μg/ml)和MIC90(128 μg/ml)明顯高于胞內分枝桿菌(MIC50=2 μg/ml，MIC90=16 μg/ml)。前兩篇來自國外的研究結果與國內研究結果不同的原因，可能是由于樣本量大小的差異及藥物敏感性試驗方法的不同造成的?？死顾芈?lián)合乙胺丁醇和利福平是治療鳥分枝桿菌復合群肺病最主要的化療藥物[4]。最近一篇韓國的臨床研究表明，胞內分枝桿菌肺病的預后顯著差于鳥分枝桿菌肺病[6]。除了胞內分枝桿菌較鳥分枝桿菌有更強的毒力外，胞內分枝桿菌對利福平更高的耐藥率可能與上述不良預后相關。盡管美國胸科學會(American Thoracic Society)不建議對鳥分枝桿菌復合群進行進一步鑒定，但是鑒于本研究結果中兩個菌種明顯的耐藥譜差異，在治療前開展菌種鑒定對于制定科學有效的化療方案具有重要意義[9]。此外，筆者的體外研究表明，利福布汀比利福平表現(xiàn)出對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌更好的抗菌活性，上述結果提示將治療方案中的利福平替換為利福布汀將有助于獲得良好的治療結果。

由于肺部結構性損壞及氣道功能喪失，慢性阻塞性肺病是非結核分枝桿菌感染的高風險因素[18]。一項來自荷蘭的研究表明，慢性阻塞性肺病可能與鳥枝桿菌復合群的感染有關[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在所有合并癥中慢性阻塞性肺病與胞內分枝桿菌肺病具有很強的相關性。很多研究表明，胞內分枝桿菌與鳥分枝桿菌的生存環(huán)境不同，其中鳥分枝桿菌更適于生活在水環(huán)境中，而胞內分枝桿菌更適于生長在生物膜系統(tǒng)中[20]。因此，胞內分枝桿菌可能利用慢性阻塞性肺病患者呼吸道自我凈化能力的下降，在患者呼吸道中建立更適于其附著及生長的生物膜環(huán)境。考慮到慢性阻塞性肺病的患者一般自身基礎條件較差且預后不理想，需要對胞內分枝桿菌肺病合并慢性阻塞性肺病的患者進行早期診斷并且在治療早期開展抗分枝桿菌治療。

總之，本研究表明胞內分枝桿菌是我國最主要流行的非結核分枝桿菌。胞內分枝桿菌與鳥分枝桿菌的耐藥譜表現(xiàn)出明顯差異。鳥分枝桿菌對莫西沙星和利奈唑胺表現(xiàn)出更強的耐藥性，而胞內分枝桿菌對利福平的耐藥率更高。此外，在臨床胞內分枝桿菌肺病更易于發(fā)生在老年人群及合并慢性阻塞性肺病的患者中。本研究結果提示，臨床迫切需要對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌桿菌開展有效的菌種鑒定，從而為臨床醫(yī)生制定更合理的治療方案提供依據(jù)。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

Drug susceptibility profiles and clinical characteristics ofMycobacteriumaviumcomplex

LIYan-ming*,TONGXun-liang,PANGYu,WANGYu-feng,SONGYuan-yuan,ZHAOYan-lin.

*DepartmentofRespiratoryandCriticalMedicine,BeijingHospital,Beijing100730,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To investigate the risk factors and drug susceptibility of the differentiation betweenMycobacteriumaviumandMycobacteriumintracellularelung diseases in China, and provide the scientific evidence for the treatment ofM.aviumcomplex. Methods From 2011 to 2013, a total of 452 nontuberculous mycobacteria (NTM) strains were isolated from 6121 suspected tuberculosis patients in four TB specialized hospitals. The multilocus sequence analysis was performed to identify the species of mycobacoteia. The minimal inhibitory concentration (MIC) was used to evaluate the drug susceptibility against twelve antimicrobial agents among the strains identified asM.aviumandM.intracellulare. In addition, we analyzed the demographic and clinical characteristics of patients with NTM lung diseases caused byM.aviumandM.intracellulare. Chi square test was performed to compare the percentage of drug resistance and the distribution of demographic and clinical characteristics betweenM.aviumandM.intracellularewith SPSS14.0. The difference was declared as significant, ifP<0.05. Results Out of 452 nontuberculous mycobacteria (NTM) isolates,M.intracellulare(188/452, 41.6%) was the most frequently isolated organisms. The percentages of moxifloxacin-resistant (3/188, 1.6%) and linezolid-resistant strains (16/188, 8.5%) among theM.intracellulareisolates were significantly lower than those amongM.aviumgroup (7/65, 10.8%,P=0.003 for moxifloxacin and 26/65, 40.0%,P<0.001 for linezolid). In contrast,M.avium(25/65,38.5%) harbored lower proportion of rifampicin-resistant strains thanM.intracellulare(124/188, 66.0%,P=0.005). Among patients withM.intracellularelung diseases, the percentage of patients older than 65 years (78/188, 41.5%) and with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (98/188, 52.1%) was significantly higher than that among patients withM.avium(15/65, 23.1% andP=0.008 for older and 18/65, 27.7% andP=0.001 for COPD). Conclusion In conclusion, our data demonstrated thatM.intracellularewas the most common NTM species. The observation of this study also revealed thatM.intracellulareandM.aviumdiffered in the drug susceptibility profiles. Clinical cases ofM.intracellularelung diseases were more likely to be found in the aged population and patients with COPD comorbidity.

Mycobacteriumaviumcomplex; Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.010

“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAI 05B02)

100730北京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科(李燕明),老年醫(yī)學部(佟訓靚)；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心(逄宇、王玉峰、宋媛媛、趙雁林)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2015-05-04)