北京地區(qū)對卷曲霉素和阿米卡星耐藥結核分枝桿菌的rrs和tlyA基因突變研究

孫勇 邢青 張治國 易俊莉 王甦民 李傳友

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·論著·

北京地區(qū)對卷曲霉素和阿米卡星耐藥結核分枝桿菌的rrs和tlyA基因突變研究

孫勇 邢青 張治國 易俊莉 王甦民 李傳友

目的 探討北京地區(qū)結核分枝桿菌卷曲霉素(Cm)和阿米卡星(Am)耐藥與rrs基因和tlyA基因突變相關性。方法 采用比例法對保存的臨床菌株進行Cm和Am藥敏試驗測定，并對其中的臨床菌株rrs基因和tlyA基因進行PCR、測序分析。篩選得到了10株Am耐藥菌株、25株Cm耐藥菌株、15株Am和Cm交叉耐藥菌株，并選擇了30株敏感菌株作為對照分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，組間率的比較采用Fisher精確概率法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果tlyA基因突變結果顯示，Cm耐藥菌株有6株突變(24.0%，6/25)，與敏感菌株相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Am耐藥菌株、Am和Cm交叉耐藥菌株與敏感菌株相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在rrs基因檢測中，Am耐藥、Cm耐藥、Am和Cm交叉耐藥突變率分別有30.0%(3/10)、8.0%(2/25)和26.7%(4/15)，敏感菌株中也有10.0%(3/30)突變株，3組耐藥菌株與敏感菌株比較，差異均無統(tǒng)計學意義(F=2.353、0.06、1.161，P值均>0.05)。在3組中，rrs基因A1401G突變位點突變比例分別是10.0%(1/10)、8.0%(2/25)和13.3%(2/15)，1株在Am和Cm交叉耐藥雙位點突變，共計6株A1401G位點突變菌株，與敏感菌株比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另一突變位點C1402T在Am、Am和Cm交叉耐藥中各1株。結論 結核分枝桿菌tlyA基因可能與Cm耐藥相關，與Am耐藥不相關；rrs基因A1401G和C1402T突變可能與Am和Cm交叉耐藥有關。

結核分枝桿菌； 卷曲霉素； 丁胺卡那霉素； 細菌蛋白質類; 突變； 北京市

目前，結核病仍是最常見的傳染病之一，2013年WHO全球結核病報告發(fā)現(xiàn)僅2012年新增860萬結核病患者，130萬例死于結核病，同時3.6%的新發(fā)患者和20%的復治患者為MDR-TB[1]，中國5.7%的新發(fā)患者是MDR-TB，遠高于世界的平均水平[2]。由于大量對一線抗結核藥物耐藥的菌株出現(xiàn)，特別是MDR-TB的蔓延，使得結核病無法得到有效的控制和治療，所以開始聯(lián)合應用一些二線抗結核藥物，阿米卡星(amikacin，Am)和卷曲霉素(capreomycin，Cm)是其中的兩種主要的抗結核藥物。相比較一線抗結核藥耐藥分子機制的研究，這兩種抗結核藥的耐藥研究相對較少，分子機制不是十分清楚。

本研究調查了北京地區(qū)Cm和Am耐藥和敏感菌株rrs和tlyA基因分子特點，為了解本地區(qū)耐藥的分子特點，進一步分析了本地區(qū)Cm和Am是否存在交叉耐藥現(xiàn)象，為耐藥結核病的快速診斷和治療提供依據(jù)。

材料和方法

一、 材料

(一)菌種來源

菌株由北京結核病控制研究所提供，來自2008年1月至2010年12月北京豐臺區(qū)、西城區(qū)、密云縣、宣武區(qū)、崇文區(qū)、昌平區(qū)、懷柔區(qū)、順義區(qū)、東城區(qū)、房山區(qū)、大興區(qū)、通州區(qū)、石景山區(qū)、北京老年醫(yī)院、延慶縣、平谷區(qū)及北京結核病控制研究所等結核病防治機構就醫(yī)的患者，患者痰液經改良羅氏培養(yǎng)，結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，確診為肺結核，共計1480份，其中男性1101例，女性379例，年齡13～92歲，平均年齡39.1歲，菌株-80 ℃凍存。菌株根據(jù)《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》，采用對硝基苯甲酸、噻吩二羧酸肼生長實驗進行菌種鑒定，采用比例法進行藥敏試驗測定[3]，Am和Cm臨界濃度分別是40 μg/ml和40 μg/ml。

(二)主要儀器設備:

Bio-rad S1000基因擴增儀(美國Bio-Rad公司)，F(xiàn)oToDYNE凝膠成像系統(tǒng)(美國Image公司)，Nanodrop2000核酸分析儀(美國Thermo公司)，ESCO Ⅱ生物安全柜(新加坡ESCO公司)。

二、方法

(一)菌株復蘇培養(yǎng)

采用改良羅氏培養(yǎng)復蘇培養(yǎng)菌株、比例法做Am和Cm的藥物敏感性試驗。

(二) 基因組提取

采用酚/氯仿抽提的方法提取結核分枝桿菌基因組[4]。

(三)基因擴增

本研究利用primer premier 5.0探針對rrs基因和tlyA基因的全序列設計引物，引物序列及退火溫度詳見表1。PCR擴增采用50 μl體系、PFU DNA聚合酶(北京Generay公司)。

(四)PCR純化

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠中電泳，用DNA凝膠回收試劑盒(杭州Axygen公司)回收DNA擴增片斷，分別送北京擎科新業(yè)和北京金唯智生物科技公司測序。H37Rv的標準序列來自結核數(shù)據(jù)庫網站[5]，用DNAMAN Version 5.2.2軟件進行序列比對。

表1 結核分枝桿菌rrs和tlyA基因擴增引物

三、統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，組間率的比較采用Fisher精確概率法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 藥敏試驗結果

共計收集1480株菌株，經比例法測定藥敏試驗結果，Am耐藥菌株11株(0.7%，11/1480)、Cm耐藥菌株28株(1.9%，28/1480)，Am和Cm交叉耐藥菌株19株(1.3%，19/1480)，Am和Cm均敏感菌株共1422株(95.6%，1415/1480)。

二、 基因組提取、PCR擴增結果

58株耐藥菌株和隨機選取30株Am和Cm均敏感菌株做為對照菌株進行抽提基因組，并對tlyA基因和rrs基因經特異性引物PCR擴增，由于抽提基因組或PCR的原因，成功擴增到10株Am耐藥菌株，25株Cm耐藥菌株、15株Am和Cm交叉耐藥菌株的tlyA和rrs基因，得到相應片斷的DNA條帶，經凝膠回收對PCR產物進行純化，公司測序比對后證實即為tlyA基因和rrs基因片斷。

三、 基因突變結果

本研究共收集到50株Am和Cm耐藥菌株，其中10株Am耐藥菌株、25株Cm耐藥菌株及15株Am和Cm交叉耐藥菌株，此外還有30株Am和Cm均敏感的菌株。從表格2結果顯示，Am耐藥菌株和敏感菌株中均未發(fā)現(xiàn)tlyA基因突變株；Cm耐藥菌株有6株突變24.0%(6/25)，包括E59K、F185C、L160終止子各1株、1株插入突變(683位點插入A)、1株缺失突變(534位點缺失T)和1株聯(lián)合突變(471插入T，K182N，Q184L)，敏感菌株中無突變發(fā)生，耐藥菌株與敏感菌株差異有統(tǒng)計學意義(F=4.603，P<0.05)；Am和Cm交叉耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)1株(6.7%,1/15)tlyA基因同義突變(V225V)；Am耐藥菌株，Am和Cm交叉耐藥菌株的tlyA基因耐藥菌株與敏感菌株比較，差異均無統(tǒng)計學意義(F=0、2.045，P值均>0.05)。

在rrs基因檢測中，發(fā)現(xiàn)Am耐藥、Cm耐藥、Am和Cm交叉耐藥分別有30.0%(3/10)、8.0%(2/25)、26.7%(4/15)突變，敏感菌株中也有10.0%(3/30)突變株，3種耐藥菌株與敏感菌株比較，差異均無統(tǒng)計學意義(F=2.353、0.06、1.161，P值均>0.05)。從突變類型上A1401G最多，在3種耐藥組中分別有10.0%(1/10)、8.0%(2/25)、13.3%(2/15)，此外還有1株在Am和Cm交叉耐藥雙位點突變，共計6株A1401G位點突變菌株，與敏感菌株比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.764，P>0.05)：A1401G和A513C，此雙位點突變同樣出現(xiàn)在敏感菌株中。同時A513C在Am耐藥中有1株，2株在敏感菌株中。另一突變位點C1402T在Am、Am和Cm交叉耐藥中各1株(表2)。

表2 tlyA、rrs基因突變在對Am和Cm耐藥與敏感菌株中的分布

注a：與敏感菌株數(shù)量相比較，F(xiàn)=0、2.045，P>0.05；b：與敏感菌株數(shù)量相比較，F(xiàn)=4.603，P<0.05；c：為廣泛性耐藥菌株；d：與敏感菌株數(shù)量相比較，F(xiàn)=2.353、0.06、1.161，P>0.05

討 論

目前Am和Cm屬于二線抗結核藥物，應用的不是很廣泛，耐藥比例相對較低，如本研究1480株菌株，Am、Cm及Am和Cm交叉耐藥菌株3組比例分別約占到0.7%、1.9%、1.3%。耐藥比例低，也顯示了其抗結核的廣泛應用前景，但國內外針對Am和Cm耐藥的專項研究相對較少，對本地區(qū)的Am和Cm耐藥分子特點和耐藥機制進行研究，從而可以有效的應用Am和Cm二線抗結核藥物，預防XDR-TB的發(fā)生。

Cm是屬于多肽類抗生素，其結構和紫霉素相似，療效似鏈霉素，但對耐鏈霉素的患者仍有效，對空洞性肺結核尤為顯著。其作用主要通過綁定23S和16S核糖體(rrs)干擾結核分枝桿菌的核糖體翻譯抑制細菌的生長，rrs基因的突變導致Cm藥物作用靶點的改變，藥物失去作用，從而產生耐藥[6-9]。目前研究rrs基因A1401G的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點是Cm耐藥主要的突變位點[10-12]。Am屬于氨基糖苷類抗生素，和Cm一樣是治療MDR-TB的重要抗結核藥物。目前研究認為Am耐藥主要與rrs和tlyA基因突變相關，但其突變位點復雜[9,13]。多數(shù)研究認為Cm和Am存在交叉耐藥的關系[12,14]。

一、tlyA基因與Am和Cm耐藥相關性分析

Maus等[15]通過體外誘導tlyA基因的SNP位點為野生型，恢復了耐藥菌株對Cm的敏感度，驗證了tlyA基因突變導致Cm耐藥的發(fā)生。研究認為tlyA蛋白和核糖體甲基轉移酶具有同源性，它通過調節(jié)細菌核糖體的甲基化，達到殺菌作用，而tlyA基因的突變使得核糖體缺少了甲基化，導致耐藥的產生[16]，但tlyA基因突變位點較復雜，而且臨床菌株中突變率相對較低[11]。Engstr?m等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)55株Cm耐藥菌株中僅有2株發(fā)現(xiàn)了tlyA基因突變(N236K)，而且敏感菌株中也發(fā)現(xiàn)了2株發(fā)生了突變(A5V和A29V)，因此他們得出結論tlyA基因的突變不會導致Cm耐藥，tlyA基因并不是一個敏感的Cm耐藥檢測指標。Jugheli等[12]更是在145株Am、Cm和Km耐藥菌株中未發(fā)現(xiàn)tlyA基因突變，這和我們的結論正好相反，本研究測序發(fā)現(xiàn)50株臨床耐藥菌株中，有7株菌株發(fā)生了tlyA基因突變，其中6株在Cm耐藥菌株中，在Am和Cm交叉耐藥菌株中有1株同義突變，30株敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)突變，提示tlyA基因可能與Cm耐藥相關，同時在Am耐藥菌株中也未找到tlyA基因突變，因此其可能與Cm和Am交叉耐藥不相關。

二、其他地區(qū)tlyA基因與Am和Cm耐藥相關性分析

目前tlyA基因研究相對較少，因此我們總結了分析其他地區(qū)Am和Cm與tlyA基因突變相關性的研究(表3)，分析其他地區(qū)耐藥分子特點及地區(qū)差異性。從表 3中發(fā)現(xiàn)各地區(qū)tlyA基因突變率較低(<8%)，而且基本相互之間沒有相同的突變位點，突變率略低于本研究比例(12.1%，7/58).tlyA基因不如rpoB基因和利福平耐藥相關性強(突變率約90%)[18]，這可能也是tlyA基因不被一些專家認可的重要原因。Georghiou等[13]也回顧性分析了全球8個tlyA基因與Am、Cm和Km耐藥相關性的研究，他們發(fā)現(xiàn)在全部366株Cm耐藥菌株中，tlyA基因突變率較低，僅占到了1%～3%，但在559株敏感菌株中未發(fā)生突變，因此他們認為tlyA基因突變是一個高特異度的Cm耐藥鑒定指標。這種相互矛盾結果的產生可能和地區(qū)差異或tlyA基因自身的突變特點有關，各地區(qū)主要流行的結核分枝桿菌類型不同所造成基因突變的位點也不盡相同；另外，tlyA基因突變率較低和它突變的多態(tài)性也可導致研究之間差異不同，所以盡管在Cm耐藥菌株中tlyA基因敏感度較低，但它有很強的特異度，因此結合Georghiou[13]等的研究結果，我們認為tlyA基因突變仍是診斷Cm耐藥的指標之一。

三、rrs基因與Am和Cm耐藥相關性分析

此前已有學者認為rrs基因A1401G突變是檢測Am耐藥較好的診斷價值，特異度100%，敏感度也達到了94.2%[12]；筆者總結了全球各地的Am和Cm與rrs基因突變相關性的研究，如表3所示，rrs基因突變率明顯高于tlyA基因，其中僅A1401G位點突變率達到了50%～90%。盡管我們針對的rrs基因全序列完成了測序，但研究發(fā)現(xiàn)rrs基因突變主要集中在A1401G、C1402T和A513C三個位點，突變率15.5%(9/58)，遠低于其他研究的比例，這可能與本研究耐藥菌株較少有關。我們發(fā)現(xiàn)A1401G單突變在Am、Cm、Am和Cm交叉耐藥菌株三組中均有出現(xiàn)，敏感菌株中并未發(fā)現(xiàn)，其中2株Am和Cm交叉耐藥菌株中1例為XDR-TB，提示我們A1401G突變可能與交叉耐藥相關。Manus等[14]和Du等[10]的研究證實了A1401G的突變位點不僅和3種抗結核藥物高水平耐藥相關，而且也是它們交叉耐藥的位點。本研究中，C1402T在Am、

表3 對Am和Cm耐藥的結核分枝桿菌在不同國家和地區(qū)的tlyA基因和rrs基因突變分子特點

注 NO：表示沒有數(shù)據(jù)；小括號內數(shù)字表示：(突變數(shù)/耐藥菌株數(shù)，突變率)

Am和Cm交叉耐藥菌株中各有1株，2株耐藥菌株均為XDR-TB菌株，如果C1402T是XDR-TB的特異性突變位點，那可以快速方便的鑒定XDR-TB，大大節(jié)約了時間和費用，但其他研究并沒涉及這一方面，進一步驗證還需要擴大樣本進行研究；本研究中并未發(fā)現(xiàn)G1484T突變位點。Maus等[14]研究也認為C1402T和G1484T位點也與Am和Cm交叉耐藥相關。Khanna等[20]在XDR-TB的耐藥基因的檢測中，發(fā)現(xiàn)了A1401G和G1484T和Am、Cm和Km的相關性。Manus等[14]研究認為A1401G、C1402T和G1484T三個突變位點中，每一個突變位點都是獨立的交叉耐藥位點。Georghiou等[12]回顧性分析了22個相關研究發(fā)現(xiàn)，在400個耐藥菌株中，C1402T和G1484T位點突變率比較低，均不到1%，同時在Cm敏感菌株中，有7%的A1401G位點突變，因此他們得出結論是A1401G可以診斷Am和Km耐藥，但不是判斷Cm耐藥的特異性指標。本研究中還發(fā)現(xiàn)A513C突變位點有2株在耐藥菌中，其在Am和Cm交叉耐藥菌株有1株，但在敏感菌株中也有3株發(fā)生突變，因此其是否與耐藥或交叉耐藥相關需要進一步研究。

四、Am和Cm耐藥分子特點研究的臨床意義

鑒定交叉耐藥可以有效指導臨床用藥，如果患者對于Cm耐藥，那么就可以認為Am也存在耐藥不再應用，而使用其他抗結核藥物，提高了治療效果和效率；如果患者對于Am和Cm都敏感，那么就可以使用便宜的Am，減輕了患者的負擔。由于Am 和Cm等藥物耐藥導致XDR-TB的發(fā)生，Perdigo等[21]檢測到MDR-TB菌株中30.8%的rrs基因A1401G 和 42.3%的tlyA基因 Ins755GT突變，因此研究tlyA、rrs基因突變對于廣泛性耐藥結核分枝桿菌的分子特點研究和臨床用藥有指導意義。

五、目前研究現(xiàn)狀及本研究不足之處

由于各地區(qū)tlyA基因突變率較低和rrs基因突變的差異，還有70%～80%耐藥菌株無法解釋耐藥機制[13]，因此學者也對其他基因進行了研究，認為eispromoter和gidB等基因可能和Am、Cm耐藥相關[11,13,17]。此外，Kumar等[22]研究認為Rv1876和Rv3224基因可能和結核分枝桿菌的鐵離子的調節(jié)和代謝相關，從而導致其對二線藥物Km和Am的耐藥。目前，盡管這些研究的耐藥突變比例較低，但卻拓展了其耐藥分子機制的研究，增加了Am和Cm耐藥診斷的敏感度和特異度，為將來快速診斷的研究提供了依據(jù)。

總之，我們的結果表明tlyA基因可能與Cm耐藥相關，與Am耐藥不相關，在rrs基因A1401G和C1402T位點可能與Am和Cm交叉耐藥有關。由于tlyA基因和rrs基因突變比例較低，因本研究從北京地區(qū)3年的部分臨床株僅篩選到50株耐藥菌株，有一定局限性。但也說明了Cm和Am耐藥率較低，有較強的臨床應用前景。所以需進一步擴大樣本，同時針對其他耐藥機制，如細胞膜的通透性、外排泵或其他耐藥基因等進行進一步的研究。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

MycobacteriumtuberculosisrrsandtlyAgene of mutations correlates with resistance to capreomycin and amikacin from Beijing

SUNYong*,XINGQing,ZHANGZhi-guo,YIJun-li,WANGSu-min,LIChuan-you.

*ClinicalLaboratoryBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

LIChuan-you,Email:lichuanyou6688@hotmail.com

Objective To explore theMycobacteriumtuberculosisofrrsandtlyAgenes mutations associated with capreomycin and amikacin resistance in Beijing. Methods The preservation of clinical strains were idenfitied capreomycin and amikacin susceptibility by proportion method, and were performed to identify clinical strains ofrrsandtlyAmutations by PCR and sequencing analysis. There were 10 cases of amikacin resistant strains, 25 cases of capreomycin resistant strains, 15 cases of amikacin and capreomycin cross resistant strains, and 30 cases of sensitive strains were as the contrast analysis. SPSS 17.0 is used for data statistical analysis, group rate is compared with the Fisher exact probability test,P<0.05 is considered statistically significant difference. Results The results oftlyAgene mutations showed that six mutant strains (24%,6/25) had drug resistant strains of capreomycin, compared with the sensitive strain was statistically significant (P<0.05)，Am, Am and Cm cross resistance strains compared with susceptible strains had no statistical significance (P>0.05)；Am, Cm, Am and Cm cross resistance of mutations rate were respectively 30.0% (3/10), 30.0% (2/25), 26.7% (4/15) inrrsgene, sensitive strains of mutations rate was 10.0% (3/30), three groups of drug resistant strains and sensitive strains were not statistically significant difference (F=2.353、0.06、1.161，P>0.05).In three groups, the A1401G ofrrsgene mutations rate were respectively 10.0% (1/10), 8.0% (2/25), 13.3% (2/15), one strain was double mutations site in the Am and Cm cross resistance group, 6 strains were A1401G mutation strains, compared with the sensitive strain had no statistical significance (P>0.05). The C1402T ofrrsgene mutations had respectively one stains in the Am, Am and Cm cross resistance groups. Conclusion Mutations oftlyAgene may be associated with capreomycin resis-tance, and was not relevant to amikacin resistance; Mutations ofrrsgene A1401G and C1402T could be related to amikacin and capreomycin cross resistance inMycobacteriumtuberculosisstrains.

MycobacteriumtuberculosisCapreomycin； Amikacin； Bacterial poteins; Mutation； Beijing city

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.009

首都醫(yī)學發(fā)展基金(2009-1055)；北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學發(fā)展專項 (ZYLX201304)

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院檢驗科(孫勇)，細菌免疫學研究室 耐藥結核病研究北京市重點實驗室(李傳友)；北京結核病控制研究所檢驗科(邢青、易俊莉、王甦民)；北京市昌平區(qū)結核病防治所檢驗科(張治國)

李傳友，Email:lichuanyou6688@hotmail.com

2015-03-19)