雞源致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

楊建珍，朱紅英

（新干縣畜牧獸醫(yī)局,江西 吉安 331300）

大腸埃希菌(E．coli)是家禽最常見(jiàn)的病原菌之一。雞大腸桿菌病是由致病性埃希氏大腸桿菌所致的一種雞的常見(jiàn)多發(fā)病，有原發(fā)性的，也有并發(fā)或繼發(fā)性的。發(fā)病率及死亡率高。該病目前已成為危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌性傳染病之一[1]。該病的流行無(wú)明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，尤以冬末春初易發(fā)。主要危害幼雞和肉雞。病型復(fù)雜，臨床上主要所致疾病有：大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌性肉芽腫、氣囊炎、滑膜炎、肝周炎、頭腫綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、全眼球炎及臍炎[2]。雞大腸桿菌病的發(fā)生具有一定的條件性，病原可能是外來(lái)的致病型大腸桿菌，也可能是體內(nèi)正常情況下存在的大腸桿菌，當(dāng)環(huán)境因素改變或發(fā)生應(yīng)激因素引起發(fā)病[3]。病雞和帶菌雞的糞便、呼吸道勃液及蛋內(nèi)和蛋殼表面帶有大量的致病性大腸桿菌，常造成禽舍環(huán)境、用具、飼料、飲水等的嚴(yán)重污染，成為本病傳播的主要原因[4]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化發(fā)展，雞大腸桿菌病不斷蔓延，其波及的雞種、發(fā)病率及嚴(yán)重程度呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，已居雞細(xì)菌性疾病之首，給養(yǎng)雞戶(hù)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害了養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[5]。

新干縣一規(guī)?；u場(chǎng)的5～7周齡雞突然發(fā)病，發(fā)病率為100%，病死率為60%左右。主要癥狀為劇烈腹瀉，精神沉郁，眼瞼腫脹，有的雞迅速死亡。通過(guò)對(duì)死雞肝臟和活雞肝臟中病原菌的分離及生化鑒定，為該雞場(chǎng)的病情診斷提供了依據(jù)，最后通過(guò)藥敏試驗(yàn)初步得出其敏感藥物，為疾病的臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料。無(wú)菌條件下取新干縣某規(guī)模雞場(chǎng)送檢的病死雞和病雞肝臟。

1.1.2 染色液。革蘭氏碘液、草酸銨結(jié)晶紫、95%酒精、沙黃水溶液、生理鹽水。

1.1.3 藥敏紙片?？敲顾?、壯觀霉素、紅霉素、阿奇霉素、青霉素、硫酸新霉素、泰樂(lè)菌素、桿菌肽、甲氧芐啶、安來(lái)霉素。以上藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司或自制。

1.1.4 生化試劑。腸桿菌科生化鑒定試劑盒購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5 普通瓊脂培養(yǎng)基。胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉10g、瓊脂2%。

1.1.6 其它器材。37℃生化培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、普通顯微鏡、電子天平、電爐、超凈臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 病料的采集。無(wú)菌采集病死雞和病雞肝臟，并標(biāo)記為病料A和病料B。迅速置于4℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)菌分離。無(wú)菌條件下取病料A和B分別用接種環(huán)接種到普通瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)和菌落特征。

1.2.3細(xì)菌純化及增菌。分別取初步分離的A菌株和B菌株的單菌落劃線(xiàn)接種于新的普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后挑選典型菌落接種于普通肉湯中，置搖床中以220rpm/min震蕩培養(yǎng)9h，得到A菌株和B菌株的純培養(yǎng)物。

1.2.4 革蘭氏染色。按照常規(guī)方法涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢[6]。

1.2.5 生化試驗(yàn)。用接種環(huán)分別把A菌株和B菌株的純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、乳糖、蛋白胨水等微量發(fā)酵管中，并置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h，觀察微量發(fā)酵管顏色變化。

1.2.6 藥物敏感試驗(yàn)。采用圓紙片擴(kuò)散試驗(yàn)。具體操作：用滅菌棉簽從普通肉湯中蘸取A菌株和B菌株的純培養(yǎng)物致密涂布于普通瓊脂平板表面，可重復(fù)來(lái)回涂布，用無(wú)菌鑷子將各種抗菌藥物圓紙片，分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等，37℃培養(yǎng)24h觀察并記錄結(jié)果[6~7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，37℃培養(yǎng)24h后長(zhǎng)出菌落，直徑為1～3mm，圓形、凸起、光滑、濕潤(rùn)、半透明、灰白色、邊緣整齊。

2.2 分離菌形態(tài)及特征

該菌經(jīng)革蘭氏染色呈陰性，兩端鈍圓的短桿菌，多呈單個(gè)或成雙存在，不形成芽胞，能運(yùn)動(dòng)。大小一般為 0.4～0.7μm。

在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～9h后，呈均勻渾濁，管底有少許粘液狀沉淀，液面與管壁可形成菌膜?？芍摼谄胀ㄈ鉁屑纯缮L(zhǎng)良好。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

本菌生化反應(yīng)活躍，能分解葡萄糖、乳糖、衛(wèi)茅醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解尿素，不產(chǎn)生硫化氫，不能利用枸櫞酸鹽，靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陰性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性。苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)呈陰性（表1、表2）。

表1 A菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

表2 B菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表4 B菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果mm

表3 A菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果mm

分離的2株雞致病性大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：A、B兩菌株都僅對(duì)阿奇霉素高度敏感，對(duì)壯觀霉素、青霉素中度敏感，對(duì)卡那霉素、紅霉素、甲氧芐啶等低度敏感或不敏感（表3、表4）。

3 討論

鑒于雞群發(fā)病后表現(xiàn)的癥狀如病雞精神沉郁，縮頭閉眼，腹部膨滿(mǎn)羽毛逆立，廢食，劇烈腹瀉，排黃綠色稀糞等，與大腸桿菌病極為相似，故直接用普通瓊脂培養(yǎng)基平板劃線(xiàn)分離培養(yǎng)，根據(jù)分離菌菌落的特征，并經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，A、B兩菌株的特性相同，均符合大腸桿菌的特性，表明為同一病原菌。初步認(rèn)定為大腸桿菌。由生化鑒定結(jié)果可知：該菌可發(fā)酵葡萄糖、乳糖及衛(wèi)矛醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不產(chǎn)硫化氫，不分解尿素；靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陰性；苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)及枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn)均為陰性。這些生化特征進(jìn)一步證實(shí)本次分離菌為大腸桿菌。由表3可知該菌僅對(duì)阿奇霉素高度敏感，對(duì)青霉素和壯觀霉素中度敏感，對(duì)其他所用抗生素不敏感或低度敏感，這也正體現(xiàn)了大腸桿菌的耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣的特點(diǎn)。

多年來(lái)，對(duì)付大腸桿菌的主要措施是應(yīng)用抗生素，其副作用是致使大腸桿菌病的耐藥菌株越來(lái)越多，耐藥譜也越來(lái)越廣[9]。一些雞場(chǎng)為了控制大腸桿菌和其他細(xì)菌感染，在飼料中添加或在治療過(guò)程中盲目使用抗生素也是造成大腸桿菌耐藥性嚴(yán)重的重要原因。據(jù)有關(guān)報(bào)道，目前大腸桿菌對(duì)包括慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、青霉素、氟哌酸等藥物都不同程度地產(chǎn)生了耐藥性[10]。由于不同菌株對(duì)藥物的敏感性存在差異，建議在使用藥物治療病原菌時(shí)要加強(qiáng)對(duì)病原菌耐藥性的檢測(cè)。因此對(duì)病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出對(duì)病原菌敏感的藥物，指導(dǎo)臨床合理用藥，可有效減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[11]。

大腸桿菌耐藥性菌株越來(lái)越多，耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，給預(yù)防和治療帶來(lái)了較大的困難。建議從飼養(yǎng)管理著手搞好環(huán)境衛(wèi)生，對(duì)禽舍及用具經(jīng)常消毒，注意育雛期保溫及飼養(yǎng)密度，飼料應(yīng)無(wú)糞便污染，營(yíng)養(yǎng)要全面[12]。

[1]史喜菊,鄭明學(xué),馮柴.雞大腸桿菌病最新研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè),2000（8）：14～15.

[2]劉遠(yuǎn)見(jiàn),蔡海建.病雞及病死雞大腸桿菌的分離鑒定[J]，山東畜牧獸醫(yī)，2009（2）：24～25.

[3]王鐵良.遼寧省雞大腸桿菌分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2009（7）：64～65.

[4]侯勝,劉德全.雞大腸桿菌病的病因及防控措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn),2010（1）：126～127.

[5]陸宗允,朱永仁.雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（4）：44～45.

[6]姚火春主編.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].第二版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001,20～45.

[7]陳杖榴主編.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].第二版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001,211～221.

[8]陸承平主編.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第二版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001，215～223.

[9]刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002(1)：21～23.

[10]白同臣,曲海波，吳金，等.雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007(9)：78～79.

[11]曾麟.大腸桿菌耐藥性的測(cè)定 [J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2010(1)：12～13.

[12]楊明凡，李曉峰，陳紅英，等.雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(11):78～79.