NMR測(cè)定丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品中有機(jī)溶劑殘留*

許 磊 ，王 萌 ，王躍飛 ，姜苗苗

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

NMR測(cè)定丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品中有機(jī)溶劑殘留*

許 磊1，2，王 萌1，王躍飛1，姜苗苗1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

[目的]用定量核磁共振（QNMR）技術(shù)建立中藥來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)品化合物丹酚酸B中殘留甲醇、乙醇和乙酸含量的快速分析方法。[方法]采用BRUKERAVANCEⅢ600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀采集譜圖，觀頻率600.23MHz，測(cè)定溫度298 K。譜寬12 019.2 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65 536，掃描次數(shù)16次，延遲時(shí)間15 s。[結(jié)果]所有標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.22～2 430mg/L范圍內(nèi)線性良好（r2＞0.999 5)，平均回收率（n＝6）在105%～109%之間。[結(jié)論]本方法快速、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于樣品有機(jī)溶劑殘留的檢測(cè)。

液體核磁共振；有機(jī)溶劑殘留；丹酚酸B；定量分析

中藥標(biāo)準(zhǔn)品化合物，是指中藥中特征的化學(xué)成分或有效的化學(xué)物質(zhì)，在中藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制規(guī)范和方法中，作為定量控制的標(biāo)準(zhǔn)參照化合物[1]。中藥標(biāo)準(zhǔn)品化合物純度是中藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制的關(guān)鍵。在中藥標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)制備過(guò)程中，常使用大量的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取、分離和純化，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品中不可避免存在有機(jī)溶劑殘留。因此，有機(jī)溶劑殘留分析是中藥的標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)制備的重要環(huán)節(jié)。目前，有機(jī)溶劑殘留量檢測(cè)普遍采用氣相色譜法[2-5]。但其操作復(fù)雜、耗時(shí)，未知樣品難以判斷其殘留有機(jī)溶劑種類，對(duì)于甲酸、乙酸等不易揮發(fā)溶劑響應(yīng)較差，而且儀器精密度受溫度、壓力、流動(dòng)相等因素影響大。

近年來(lái)，儀器裝置長(zhǎng)足發(fā)展，核磁共振已經(jīng)成為強(qiáng)有力的分析工具，在藥物分析領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[6-8]。核磁共振波譜用于定量分析不需要為每一種被測(cè)物選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。中藥標(biāo)準(zhǔn)品分離困難，價(jià)格昂貴，不易獲得，而核磁共振波譜不破壞樣品，樣品可以反復(fù)利用?？梢酝瑫r(shí)對(duì)有機(jī)溶劑定性定量分析，利用核磁共振波譜分析具有優(yōu)勢(shì)。

丹參為傳統(tǒng)中藥，具有舒張血管、保護(hù)心肌、抗氧化、抗凝和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的多種功效[9-10]，丹酚酸B是丹參的主要水溶性成分，具有多方面的藥理活性[11-14]，常作為評(píng)價(jià)丹參質(zhì)量的指標(biāo)性成分。在其分離純化過(guò)程中常使用甲醇、乙醇、乙酸等有機(jī)溶劑，該實(shí)驗(yàn)以丹酚酸B為研究對(duì)象，運(yùn)用定量核磁共振技術(shù)（QNMR）建立丹酚酸B中甲醇、乙醇、乙酸殘留的檢識(shí)方法，具有操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、不破壞樣品、無(wú)偏向性等優(yōu)點(diǎn)，滿足藥物有機(jī)溶劑殘留的檢測(cè)，可為建立其他中藥標(biāo)準(zhǔn)品中機(jī)溶劑殘留量的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器及試劑

BRUKERAVANCEⅢ600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司），質(zhì)子激發(fā)頻率600.23MHz，配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀。5mm標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管（美國(guó)NORELL公司）。D2O（氘代度 ＞ 99.8%，美國(guó) NORELL 公司）；3－（三甲基甲硅烷）丙酸－d4鈉鹽（TSP，氘代度 ＞98%，美國(guó) Sigma－Aldrich公司）；甲醇（≥99.5%）、乙醇（≥99.7%）、冰乙酸（≥99.5%）（均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠）；丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（中新藥業(yè)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 分別稱取甲醇、乙醇和乙酸適量，精密稱定，置容量瓶中，加D2O（含內(nèi)標(biāo)TSP 0.2 g/L）溶液稀釋至刻度，得到甲醇濃度為0.84 g/L，乙醇濃度為0.078 g/L，乙酸濃度為2.43 g/L。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取供試品10mg，加入0.5mLD2O（含內(nèi)標(biāo)TSP 20 g/L），轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，直接用于1H-NMR測(cè)試。

2.2 分析方法 采用30°脈沖序列zg30采集樣品溶液的1H-NMR圖譜。測(cè)定溫度298 K，觀測(cè)頻率600.23MHz，譜寬 12 019.2Hz，90°脈沖寬度 13 μs，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65 536，掃描次數(shù)16次，延遲時(shí)間15 s，接受增益128。用TSP信號(hào)定標(biāo)。

2.3 殘留溶劑分析 核磁共振定性鑒定和定量分析可同步完成，定性鑒定有機(jī)溶劑無(wú)須標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用譜圖化學(xué)位移、耦合常數(shù)、質(zhì)子數(shù)以及NMR數(shù)據(jù)[15]，鑒定了樣品中甲醇、乙醇和乙酸信號(hào)峰，見(jiàn)圖1。

QNMR用于定量分析的基礎(chǔ)是各化學(xué)環(huán)境中的質(zhì)子吸收峰的面積只與所包含的質(zhì)子數(shù)有關(guān)，不需引進(jìn)任何校正因子就可直接根據(jù)各共振峰的積分值推算所代表的自旋核的數(shù)量[16]。定量的樣品峰應(yīng)選擇無(wú)其他共振峰干擾。故選擇δ3.34處單峰為甲醇定量峰，δ1.19處峰為乙醇定量峰，δ1.94處峰為乙酸定量峰，見(jiàn)圖1。

圖1丹酚酸B的一維1H-NMR譜圖Fig.1 Representative1D 1H-NMR spectraofSalvianolicacid B

2.4 線性關(guān)系和范圍 精密移取對(duì)照品貯備液，加D2O溶液配制為7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度備用。分別精密量取0.5mL于5mm核磁管中，記錄NMR氫譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)濃度X（g/L）對(duì)定量峰與內(nèi)標(biāo)物峰積分面積之比Y進(jìn)行線性回歸，得到3種被測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)分別是甲醇：Y=8.934X+0.812 6 （r2＝0.999 6）；乙醇：Y＝5.709 4X＋0.041 5（r2＝0.999 8）；乙酸：Y＝5.023 9X＋0.005 8（r2＝1）。

結(jié)果表明，甲醇進(jìn)樣量在13～840mg/L，乙醇進(jìn)樣量在1.22～78.3mg/L，乙酸進(jìn)樣量在38～2 430mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液0.5mL，連續(xù)測(cè)試6次，以甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面積計(jì)算，RSD（n＝6）分別為 1.02%、0.64%和 0.38%，精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取丹酚酸B共6份，精密稱定，在上述條件下進(jìn)行測(cè)定，以甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面積計(jì)算，RSD（n＝6）分別為1.52%、1.34%和0.88%，重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液0.5mL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 測(cè)定，甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面積的 RSD（n＝6）分別為 1.21%、1.15%和 0.78%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)加入回收率 取供試品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下分析條件，計(jì)算各樣品有機(jī)溶劑的殘留量。計(jì)算含量結(jié)果見(jiàn)表1。樣品的典型1H-NMR圖譜見(jiàn)圖1。

向供試品加入已知濃度的3種殘留有機(jī)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)液，在最佳條件下測(cè)得3種殘留有機(jī)溶劑的加標(biāo)回收率（n＝6）分別為 108.2%（甲醇）、107.3%（乙醇）、105.6%（乙酸）。結(jié)果表明，本方法適用于丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有機(jī)溶劑殘留測(cè)定。

表1樣品分析結(jié)果Tab.1 Determ ination resultsof sam ples %

3 討論

為了獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中考察了3種不同脈沖序列（zg30，zg，zgcppr）對(duì)定量結(jié)果影響，其他條件與上述相同。分別用3種脈沖序列測(cè)定已知濃度的有機(jī)溶劑標(biāo)準(zhǔn)物的含量，結(jié)果以zg30和zg脈沖序列測(cè)試1H-NMR圖譜峰行較好，定量準(zhǔn)確，而zgcppr壓制水峰序列對(duì)測(cè)定影響較大，這可能是由于該序列容易引起信號(hào)峰畸變對(duì)其他信號(hào)峰也有較大影響。zg為90°脈沖，小角度脈沖zg30可在較短時(shí)間內(nèi)獲得充分弛豫[17]，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，因此優(yōu)選zg30為實(shí)驗(yàn)測(cè)試序列。

核磁共振定量，通過(guò)比較被測(cè)樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)峰峰面積，即可以對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)以3-（三甲基甲硅烷）丙酸-d4鈉鹽（TSP）為內(nèi)標(biāo)物，在D2O中有良好的溶解度，與D2O和待測(cè)物互相不反應(yīng)。TSP的響應(yīng)峰值在δ0，與被測(cè)物具有良好分離度，因此被選擇為內(nèi)標(biāo)物。

有機(jī)溶劑殘留檢測(cè)屬于標(biāo)準(zhǔn)品化合物的純度測(cè)定范圍，現(xiàn)行中藥準(zhǔn)品化合物的純度鑒別主要以高效液相色譜（HPLC）法為主，而HPLC法難以鑒別有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題，影響中藥質(zhì)量控制。有機(jī)溶劑殘留測(cè)定多采用氣相色譜法，對(duì)于乙酸等不易揮發(fā)溶劑使用氣相色譜法，基本沒(méi)有頂空進(jìn)樣方式的響應(yīng)信號(hào)[18]，直接進(jìn)樣則容易導(dǎo)致樣品中非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)色譜柱的污染與損害[19]，影響有機(jī)溶劑定性。采用QNMR方法測(cè)定樣品溶劑殘留，在同一張圖譜上，可對(duì)中藥主要物質(zhì)與其殘留溶劑進(jìn)行定性定量分析，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性高的特點(diǎn)，能滿足有機(jī)溶劑殘留的分析要求。

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Determ ination of the residualorganic solvents in Salvianolic acid B by NMR

XU Lei1,2，WANGMeng1，WANGYue-fei1，JIANGMiao-miao1
（1.Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine,Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China；2.Research and DevelopmentCenterof TraditionalChineseMedicine,Tianjin International JointAcademyofBiotechnology and Medicine,Tianjin 300457,China）

[Objective]To establish an QNMRmethod for the determination ofmethanol,ethanoland acetic acid in Salvianolic acid B.[Methods]The1H-NMR spectrawasperformed on a Bruker AVⅢ600MHz NMR spectrometerwith a proton frequency of600.23MHz and a temperatureof298K.[Results]Each experimentconsisted of16 scanswith a spectralwidth of12 019.2Hzand a recycle delay of 15 sper scan.All the calibration curvesshowed good linearity(r2>0.999 5)in the rangeof1.22～2 430mg/L.The average recoverieswere 105%～109%（n=6）.[Conclusion]Themethod is rapid and accurate,which is helpful for the determination of the residua1 organic solvents in Salvianolic acid B.

liquid NMR;residua1 organic solvent;Salvianolic acid B;quantitative analysis

R285.5

A

1672-1519（2015）08-0501-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.08.15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303181）。

許 磊（1989－），男，碩士研究生，主要從事中藥化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

姜苗苗，E-mail：miaomiaojiang@126.com。

2015-01-05）

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