吸入氫氣對膿毒癥大鼠心肌損傷的影響

張聰聰 鞏霞 王濱 朱建昌 陳欣欣 張泉三

嚴(yán)重膿毒癥是一種嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)，可在短時間內(nèi)發(fā)展為多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），甚至死亡，它是重癥醫(yī)學(xué)中的難點，其中心肌損傷是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后。因此，早期有效的預(yù)防治療膿毒癥患者的心肌損傷成為治療的重要部分[1-2]。氫氣是一種還原性的惰性氣體，最近研究發(fā)現(xiàn)氫氣的還原性在治療急性損傷中心肌缺血再灌注損傷有特殊的作用[3]。但其對膿毒癥心肌損傷的作用不明，本研究探討吸入氫氣對膿毒癥心肌損傷的影響，為臨床上治療膿毒癥心肌損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇日齡80~90 d雄性SD大鼠48只，體重（220±25）g，購于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心，通過隨機數(shù)字法分為4組，每組各12只：假手術(shù)組（SH組）、膿毒癥組（CLP組）、1%氫氣組（1%H2組），2%氫氣組（2%H2組）。SH組作為假手術(shù)組，CLP組為膿毒癥無治療組，1%氫氣組分別在CLP術(shù)后1、6 h吸入1%氫氣1 h，2%氫氣組分別在CLP術(shù)后1、6 h吸入2%氫氣1 h。

1.2 動物模型制作 參照文獻[4]采用盲腸結(jié)扎并穿刺法制作膿毒癥大鼠模型，SH組不結(jié)扎穿刺盲腸，其他操作與CLP組相同。所有大鼠腹腔注射濃度20%的烏拉坦（0.5 mL/100 g）麻醉后固定于動物手術(shù)臺上，在腹部正中作長約3 cm的切口，探查并游離出盲腸，在距盲腸根部1 cm處用3-0絲線結(jié)扎盲腸，結(jié)扎過程勿結(jié)扎到腸系膜血管及回腸。在盲腸的腸壁的漿膜面上用18號針穿刺3次，相距0.5 cm/針，以輕輕擠壓腸管有糞便從穿刺孔中流出為準(zhǔn)，腸管仔細(xì)還納回腹腔并關(guān)腹。參照文獻[5]的方法，使用M177021氫氣發(fā)生器（北京中西遠(yuǎn)大公司），通過電解水產(chǎn)生氫氣，氫氣純度約為99.999%。將大鼠放入帶有入氣口和出氣口的密閉箱子，將氫氣和氧氣通過入氣口輸入箱子里，并在出氣口收集殘氣。使用泵吸式JSA8-H2高敏氫氣檢測儀（深圳吉順安科技有限公司）監(jiān)測出氣口H2的濃度并調(diào)節(jié)到氫氣到相應(yīng)的濃度。1%H2組和2%H2組分別在CLP術(shù)后1、6 h吸入相應(yīng)濃度的氫氣1 h，其他組進行相應(yīng)的操作但不吸入氫氣。

1.3 方法 各組大鼠均在造模成功后24 h處死，處死前用20%的烏拉坦麻醉，通過腹主動脈采集血液標(biāo)本，離心后取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISE）法測定血清中cTnI和BNP的濃度，操作嚴(yán)格參考試劑盒說明書（試劑盒購買于美國R&D公司）。處死大鼠后立即分離左心室，用冷生理鹽水將左心室的血跡沖洗干凈，取心尖處的少量心肌，用甲醛固定后進行HE染色，參照文獻[6]在光鏡下觀察心肌組織計算病理積分。在光鏡下隨機觀察10個視野，觀察并計算每個視野中心肌組織的炎癥細(xì)胞的浸潤、壞死及水腫面積與整個視野面積的比例；正常心肌計0分，<1/4計1分，1/4~1/2計2分，1/2~3/4計3分，>3/4計4分，最后計算10個視野評分算平均值。剩余的心肌組織取約1 g加入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中，制作組織勻漿并保存于-70 ℃中。用ELISE法測定ET-1、TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書（試劑盒購買于美國R&D公司）。采用硝酸還原酶法測定大鼠心肌組織中NO的含量（試劑盒購買于南京建成科技有限公司），操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（s）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清cTnI、BNP和心肌病理評分的比較 與SH組相比，其他各組大鼠血清cTnI、BNP表達(dá)水平及心肌病理評分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與CLP組相比，l%H2組和2%H2組的cTnI、BNP的表達(dá)水平及心肌病理評分明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而l%H2組和2%H2組的血清cTnI、BNP和心肌病理評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組血清cTnI、BNP和心肌病理評分的比較（s）

表1 各組血清cTnI、BNP和心肌病理評分的比較（s）

*與SH組比較，P<0.05；△與CLP組比較，P<0.05

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2.2 各組大鼠心肌ET-1和NO的比較 與SH組相比，其他各組大鼠心肌ET-1表達(dá)水平明顯升高，而NO表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與CLP組相比，1%H2組和2%H2組的大鼠心肌ET-1表達(dá)水平明顯下降，而NO表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但1%H2組和2%H2組的組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 各組大鼠心肌ET-1和NO的比較（s）

表2 各組大鼠心肌ET-1和NO的比較（s）

*與SH組比較，P<0.05；△與CLP組比較，P<0.05

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2.3 各組心肌組織中TNF-α和IL-6的比較 與SH組相比，其他各組大鼠血清TNF-α和IL-6表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與CLP組比較，各組的TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而1%H2組和2%H2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 各組心肌組織中TNF-α和IL-6的比較（s） pg/mL

表3 各組心肌組織中TNF-α和IL-6的比較（s） pg/mL

*與SH組比較，P<0.05；△與CLP組比較，P<0.05

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3 討論

膿毒癥是由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷引起的全身炎癥性反應(yīng)，是ICU中非心臟患者的常見死亡原因之一。在膿毒癥早期即常伴有不同程度的心肌損傷，表現(xiàn)為心力衰竭、低血壓、心律失常等，可導(dǎo)致其他器官的損傷。因此，膿毒癥心肌損傷的早期診斷與治療變的十分重要[7]。本研究采用CLP法制備的大鼠膿毒癥心肌損傷模型，它的機制是通過大鼠盲腸的結(jié)扎和穿孔，使腸內(nèi)容物細(xì)菌進入污染腹腔，造成大鼠的彌漫性腹膜炎，誘發(fā)全身性破壞性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，與脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥相比具有更好的臨床相關(guān)性，在動物實驗中廣泛使用[4]。

氫氣是一種呈中性的小分子，具有良好的膜通透性，能順利進入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮消除羥自由基。氫氣具有很弱的還原性，它只能和活性強的羥自由基結(jié)合反應(yīng)，但不與具有信號作用的氧自由基反應(yīng)。研究表明，氫氣在器官的缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用，其具有抗氧化、抗凋亡和抗炎癥反應(yīng)等器官保護作用[8]。但氫氣在體內(nèi)的半衰期短，只有較長時間吸入氫氣才可以很好發(fā)揮它的抗氧化作用，本研究在CLP術(shù)后1、6 h持續(xù)吸入相應(yīng)濃度的氫氣1 h[9]。

cTnI是檢測心肌損傷的重要指標(biāo)，具有較好的敏感性和特異性，正常人cTnI含量很低，在心肌損傷時cTnI顯著升高，能在一定程度上評價預(yù)后[10]。BNP是主要是由心室分泌的，具有預(yù)測膿毒癥患者的心肌損傷的價值，并具有很好的靈敏性，一般伴隨膿毒癥的康復(fù)，BNP逐步下降，心肌功能障礙得到改善[11]。本研究采用cTnI和BNP評價大鼠心肌損傷的程度，研究結(jié)果顯示：與SH組相比，其他各組大鼠血清cTnI、BNP表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與CLP組相比，1%H2組和2%H2組的cTnI、BNP的表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明膿毒癥大鼠出現(xiàn)明顯心肌損傷，而吸入氫氣可以減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的程度。

ET-1是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性多肽類小分子物質(zhì)，不僅具有強烈的收縮動靜脈血管的作用，還在心血管的內(nèi)分泌、胃腸道、腎臟等方面發(fā)揮一定作用，其中，ET-1能強烈的收縮冠狀動脈血管并減低心率[12-13]。NO是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的舒張血管的物質(zhì)，一方面它具有維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓，增加冠狀動脈血流等作用，另外，NO還可以清除自由基，降低機體脂質(zhì)過氧化的水平[14]。既往有研究表明，在心肌缺血再灌注時，心肌損傷與血漿的NO含量下降有關(guān)[15]。在一般情況下，NO和ET-1保持相對平衡，維持血管的舒縮狀態(tài)，在心肌發(fā)生缺血缺氧時，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO和ET-1比例失調(diào)，可引起冠脈血管收縮，血流量下降，進一步加重心肌的損傷[16]。研究結(jié)果顯示：CLP組大鼠心肌ET-1表達(dá)水平明顯升高，而NO表達(dá)水平明顯降低，與其他組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；吸入H2組的大鼠心肌ET-1表達(dá)水平明顯下降，而NO表達(dá)水平升高，與其他組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明膿毒癥大鼠出現(xiàn)心肌血液循環(huán)障礙引起心肌損傷，提示吸入氫氣可能通過抑制心肌微循環(huán)障礙來減輕大鼠的心肌損傷。

在膿毒癥時機體可以產(chǎn)生大量的炎性因子，可通過多種途徑造成心肌的損傷，TNF-α和IL-6是機體炎癥反應(yīng)中重要的早期應(yīng)答因子[17-19]。TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的，具有啟動和觸發(fā)炎癥反應(yīng)的作用，可誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)和黏附分子以及生長因子的表達(dá)，還具有增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用[20]。IL-6是由TNF-α激活內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的，具有趨化作用，可導(dǎo)致溶菌酶釋放和氧自由基產(chǎn)生，加重臟器的損傷[21]。研究表明，TNF-α和IL-6被認(rèn)為是在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中最主要的炎性介質(zhì)[22]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥患者血清中TNF-α和IL-6的生成明顯增加，并可以抑制心肌收縮力[23]。本次研究結(jié)果顯示：CLP組大鼠血清TNF-α和IL-6表達(dá)水平均明顯升高，通過吸入H2的TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示吸入氫氣可能通過抑制炎癥反應(yīng)來減輕膿毒癥大鼠心肌損傷。

綜上所述，吸入氫氣可以改善膿毒癥大鼠的心肌損傷，其可能機制與改善心肌組織微循環(huán)和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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