谷氨酰胺對大鼠腸缺血再灌注損傷后閉合蛋白的保護作用*

王愛麗，牛瓊，史寧，賈興芳，劉成霞

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603)

谷氨酰胺對大鼠腸缺血再灌注損傷后閉合蛋白的保護作用*

王愛麗，牛瓊，史寧，賈興芳，劉成霞△

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603)

目的:探討谷氨酰胺(Gln)對大鼠腸缺血再灌注損傷后閉合蛋白(occludin)的保護作用及其可能機制。方法:成年雄性Wistar大鼠30只隨機分為假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注損傷組(I/R組)和谷氨酰胺預(yù)處理組(Gln組)。Gln組給予谷氨酰胺1 g·kg－1·d－1連續(xù)灌胃7 d。Sham組和I/R組以同等劑量生理鹽水灌胃7 d。Sham組僅分離腸系膜上動脈而根部不夾閉。I/R組和Gln組均用無損傷血管夾夾閉SMA根部30 min后放松血管夾形成再灌注損傷模型。各組大鼠均于制模后24 h采集靜脈血和回腸標本。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中腫瘤壞死因子(TNF)－α、白細胞介素(IL)－10和IL－2水平。全自動生化儀檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)水平。免疫組化及Western blotting法檢測occludin蛋白的表達情況。結(jié)果:I/R組occludin蛋白表達明顯低于正常對照組及谷氨酰胺處理組(P＜0.05);I/R組TNF－α和MDA水平均高于sham組和Gln組(P＜0.05)。I/R組血清的SOD活力、GSH、GSH－Px、IL－10和IL－2均低于sham組和Gln組(P＜0.05)。結(jié)論:谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷后的occludin蛋白具有保護作用，其機制可能與抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

谷氨酰胺;腸缺血再灌注損傷;閉合蛋白;炎癥;氧化應(yīng)激

缺血再灌注損傷(ischemia－reperfusion injury，IR)是各種原因?qū)е陆M織器官缺血時引起的細胞代謝障礙和組織結(jié)構(gòu)破壞，當血供恢復(fù)時，組織及細胞損傷反而加重的現(xiàn)象［1］。小腸是缺血再灌注損傷最常累及的器官，在腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會引起小腸的缺血性損傷［2］。腸道黏膜屏障是防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)和病原體進人機體內(nèi)環(huán)境，并維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一道重要屏障，主要由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障4部分組成。其中，構(gòu)成機械屏障的緊密連接起到主要作用［3－4］。腸I/R損傷與其它器官I/R的損傷不同，不僅有氧自由基生成、免疫細胞應(yīng)答、炎癥因子的釋放等過程，還有缺血、缺氧導(dǎo)致內(nèi)皮細胞和上皮細胞屏障功能被破壞，進而引起細菌發(fā)生移位，可引起全身性的免疫應(yīng)答和多器官功能障礙［5］。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是腸上皮細胞重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在氧化應(yīng)激中對機體起到保護作用，也在腸道相關(guān)免疫系統(tǒng)中扮演重要角色，在腸道嚴重損傷的情況下可以不僅增加小腸吸收面積，還可以增加腸黏膜的細胞構(gòu)成［6］。本課題組的研究表明［7－8］，Gln對體外缺氧再灌注損傷的腸上皮細胞具有保護作用，本研究擬利用大鼠建立腸缺血再灌注損傷模型，探討Gln對大鼠腸缺血再灌注損傷后閉合蛋白(occludin)的保護作用及其可能作用機制。

材料和方法

1 藥物和試劑

谷氨酰胺粉末，純度99%，購自Sigma;兔抗大鼠occludin抗體購自Abcam;山羊抗兔IgG－HRP II抗、牛血清白蛋白購于南京碧波生物科技有限公司;βactin抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;Western blotting上樣緩沖液購于Fermentas;考馬斯亮藍蛋白濃度試劑盒、SOD、MDA、GSH及GSH－Px試劑盒購于南京建成有限公司;IL－2、TNF－α及IL－10 ELISA試劑盒購自廈門慧嘉生物有限公司。

2 實驗動物

32只清潔級健康成年雄性Wistar大鼠，體重220～250 g，由山東大學實驗動物中心提供，批號為SOXXK(魯)20090001。

3 實驗步驟

3.1 動物分組與處理動物隨機分為假手術(shù)組(sham);I/R組:缺血再灌注損傷模型組;Gln組:模型+Gln 1 g·kg－1·d－1。每組10只。Gln組于造模前7 d開始給予1 g·kg－1·d－1谷氨酰胺連續(xù)灌胃，sham、I/R組分別于造模前給予同等劑量生理鹽水灌胃。

3.2 動物模型復(fù)制所有大鼠術(shù)前禁食12 h，但可自由飲水，10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉。Sham組動物取腹正中切口，長約3.0 cm，用溫鹽水紗布將腸管推向左側(cè)腹腔，暴露右腎內(nèi)上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動脈分離后不作阻斷。I/R組則顯露腸系膜上動脈，用無創(chuàng)血管夾阻斷其系膜血管30 min，造成腸缺血模型，松夾再灌注24 h。Gln組顯露腸系膜上動脈，其余操作同I/R組。操作過程中所有大鼠腹腔注入37℃生理鹽水0.5 mL/kg以保持血流動力學穩(wěn)定。實驗結(jié)束后關(guān)腹。

3.3 標本取材與處理I/R再灌注24 h后再次麻醉剖腹，立即從腹主動脈采集血標本，行全血離心(4℃、3 000 r/min)。20 min后分裝血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜羧【嗷孛げ考s10 cm處4.0 cm長回腸標本，迅速用冷生理鹽水溶液沖洗，清除黏液、污物等腸腔內(nèi)容物后，用濾紙吸干，立即投入裝有10%甲醛溶液中固定，以備免疫組織化學等組織病理學檢測。

3.4 免疫組化法檢測腸組織occludin蛋白的表達情況標本置于4%多聚甲醛中固定，包埋切片。具體步驟如下:石蠟切片脫蠟至水;3%H2O2室溫孵育5～10 min;加0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，于微波爐內(nèi)修復(fù)10 min;10%山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育15 min，傾去血清，滴加I抗工作液(1∶200稀釋)，4℃過夜;滴加適量生物素標記II抗工作液，37℃孵育30 min;滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min;顯色劑顯色3 min(DAB);自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)采集圖片。

3.5 Western blotting半定量測定occludin蛋白的含量取3 cm回腸標本，縱向剪開腸腔，生理鹽水沖洗后，置于－80℃保存。將保存組織放入組織勻漿器內(nèi)，每100 mg加1 mL全蛋白提取液(0.15 mol/L氯化鈉+0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷+1.0%聚氧乙烯辛基苯基醚，每10 mL加全蛋白酶抑制劑混合片1片)研磨。12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液，測定總蛋白含量。分別取40 μg的總蛋白加入上樣緩沖液，煮沸10 min后，先行聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5 g/L BSA室溫封閉1 h，加入occludin和β－actin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜，漂洗后加入IgG－HRP II抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，漂洗、曝光成像。Quantity One軟件分析測定結(jié)果，計算目標蛋白相對含量(目標蛋白灰度值/β－actin灰度值)。

3.6 IL－2、IL－10和TNF－α含量的測定采用ELISA法測定，實驗步驟嚴格按照操作說明書進行。往血清樣品中分別加人IL－2、IL－10和TNF－α特異性抗體，最后加入反應(yīng)終止溶液，并在450 nm處測定A值。

3.7 血清SOD活性和MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸法測定血清中MDA含量;采用黃嘌呤氧化酶法測SOD活性;采用二硫代二硝基甲苯胺法測定血中GSH含量及GSH－Px活性。測定所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。操作步驟嚴格按照說明書進行。儀器采用上海產(chǎn)721型分光光度計，測定對照管及測定管的吸光度值，通過公式計算求出被測樣品的SOD、MDA、GSH及GSH－Px水平。

4 統(tǒng)計學處理

全部計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。對符合正態(tài)分布和方差齊性的資料進行單因素方差分析，組間比較采用LSD－t檢驗。輸入SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷血清中IL-10、IL-2和TNF-α的影響

I/R組血清中MDA、IL－10和TNF－α水平均高于假手術(shù)組和Gln組;IL－2、GSH、GSH－Px及SOD水平均低于假手術(shù)組和Gln組(P＜0.05);谷氨酰胺處理組與正常對照組各項指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1、2。

表1 各組大鼠血清IL-2、IL-10及TNF-α的含量Table 1.Serum levels of IL－2，IL－10 and TNF－α in the rats with different treatments(ng/L.Mean±SD.n=10)

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH和GSH-Px的含量Table 2.The serum levels of SOD，MDA，GSH and GSH－Px in the rats with different treatments(Mean±SD.n=10)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs IR.

2 谷氨酰胺對腸缺血再灌注損傷后腸組織occludin蛋白的影響

根據(jù)免疫組織化學染色結(jié)果，正常對照組中occludin蛋白分布于小腸黏膜上皮細胞膜，表達呈強棕褐色信號;腸缺血再灌注損傷組occludin蛋白表達明顯減弱，呈低表達;谷氨酰胺處理組可觀察到occludin蛋白的棕褐色信號表達較損傷組高，但弱于正常對照組，見圖1。

Figure 1.The protein expression of occludin determined by immunohistochemistry(×400).圖1 各組腸黏膜occludin蛋白表達的免疫組化結(jié)果

3 Western blotting半定量測定occludin蛋白含量

腸缺血再灌注損傷組occludin蛋白的表達明顯低于正常對照組(P＜0.05)，而谷氨酰胺預(yù)處理組occludin蛋白的表達高于腸缺血再灌注損傷組(P＜0.05)，谷氨酰胺處理組與正常對照組occludin蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 2.The protein levels of occludin by determined by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs sham;##P＜0.05 vs IR.圖2 各組腸黏膜occludin蛋白表達的Western blotting結(jié)果

討論

缺血再灌注損傷是創(chuàng)傷、嚴重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過程。小腸是對缺血再灌注損傷最敏感的器官之一，在腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會引起小腸的缺血性損傷，在組織恢復(fù)血供時，再灌注損傷會加重對小腸的損傷。同時，小腸是機體最大的細菌庫，缺血再灌注損傷消化道，削弱小腸的生理屏障功能，腸道黏膜屏障功能損傷的主要病理改變是腸黏膜通透性增加，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、腸內(nèi)細菌移位，引起大量炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合癥和多器官功能不全綜合癥的發(fā)生［1，3］。

近來人們對腸缺血再灌注損傷的機制有了更深入的認識，如黃嘌呤氧化酶和氧自由基［9－10］、促炎細胞介質(zhì)的釋放［11］等機制均參與腸缺血再灌注損傷。小腸絨毛富含活性氧簇相關(guān)的酶，缺血再灌注激活了腺嘌呤－次黃嘌呤代謝途徑，使氧自由基的產(chǎn)生異常增加。生物膜主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類組成，脂質(zhì)以磷脂為主，磷脂的主要成分是多聚不飽和脂肪酸，其中有多個弱鍵和不飽和鍵，氧自由基對其有很高的親和力，過多的氧自由基可激發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細胞膜性結(jié)構(gòu)中脂類過氧化，抑制線粒體酶活性，使細胞膜、溶酶體膜通透性增加，導(dǎo)致細胞膨脹破裂，破壞腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高。當此反應(yīng)鏈遇到谷胱甘肽、維生素E和維生素C等抗氧化物時就會終止。MDA是腸缺血再灌注損傷病理過程中一種代表性脂質(zhì)過氧化物，其含量可直接反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的最主要物質(zhì)，其活力的高低反映了機體清除氧自由基的能力。同時，在腸缺血再灌注損傷過程中可引起補體活化，觸發(fā)TNF－α從缺血腸黏膜釋放，所分泌的TNF－α進一步刺激促炎細胞因子，如IL－1β、IL－6、趨化因子、黏附分子從浸潤的白細胞和內(nèi)皮細胞中釋放，引發(fā)細胞因子級聯(lián)反應(yīng)。促炎細胞因子，如TNF－α、IL－6和IL－1β，成為腸缺血再灌注損傷的的主要致病因子［11－13］。促炎細胞因子進一步促進炎癥細胞黏附和浸潤到腸黏膜，并導(dǎo)致毛細血管阻塞、血管活性物質(zhì)及細胞毒性成分的釋放，最終引起多器官功能障礙綜合征［14］。炎癥也是腸黏膜損傷修復(fù)的重要因素。IL－10是一種分子量相當于18～21 kD的細胞因子，屬于Th輔助細胞2類因子Th2由各種淋巴細胞產(chǎn)生，在缺血再灌注損傷過程中，IL－10抑制活化的單核巨噬細胞合成多種細胞因子(IL－1、TNF－α、IL－6、GM－CSF及IL－8)，調(diào)節(jié)中性粒細胞功能，誘導(dǎo)肥大細胞生長，在下調(diào)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］，是目前非常受關(guān)注的抗炎介質(zhì)之一。

腸黏膜屏障是由機械屏障(包括腸上皮細胞和細胞間緊密連接)、化學屏障(各種消化液、各種消化酶、溶菌酶、黏多糖、糖蛋白、糖脂等)、微生物屏障(膜菌群、腔菌群)及免疫屏障［包括腸相關(guān)淋巴樣組、M細胞、腸道免疫球蛋白(絕大部分是sIgA)及彌散免疫細胞］共同組成的組分，其中主要由occludin蛋白構(gòu)成的緊密連接起到關(guān)鍵作用［3－4］。因此，occludin蛋白在維持細胞間連接、影響細胞活性、調(diào)節(jié)細胞旁通路通透性以及緊密連接信號調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其功能狀態(tài)對緊密連接以及上皮細胞的變化起到重要作用。Occludin蛋白的檢測結(jié)果，在一定程度上可以反映出緊密連接和腸黏膜屏障的情況。

Gln是腸上皮細胞、淋巴細胞和巨噬細胞最重要和最易利用的能源燃料［16］，是抗氧化防御系統(tǒng)中重要物質(zhì)谷胱甘肽和核苷酸等合成的前體。Wu等［17］的研究表明，Gln處理對腸缺血再灌注損傷腸黏膜具有保護作用，減輕缺血再灌注損傷。但是，Gln對腸黏膜的保護作用是否與抗氧化應(yīng)激及抗炎癥反應(yīng)有關(guān)尚未明確。因此我們利用大鼠建立腸缺血再灌注損傷模型，探討Gln對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。

本研究參照文獻［18］的方法制備小鼠腸缺血再灌注損傷模型，通過免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)，Gln處理組及正常對照組的occludin蛋白表達明顯強于缺血組，Western blotting半定量結(jié)果也證實缺血組的occludin蛋白下調(diào)。同時，我們通過與正常對照組相比，缺血組血清的TNF－α水平顯著增高，IL－10水平則顯著降低，說明缺血再灌注可以激活機體的炎癥反應(yīng)。與缺血組比較，Gln預(yù)處理組血清的TNF－α水平則顯著降低，而IL－10的含量則顯著升高，說明谷氨酰胺可以通過抑制促炎因子(TNF－α)、促進抑炎因子(IL－10、IL－2)的產(chǎn)生來減弱炎癥反應(yīng)，減輕其帶來的炎癥損害。該作用機制可能與Gln可通過直接或間接地影響細胞內(nèi)介質(zhì)如cAMP、Ca2+的水平，以增加小腸細胞間緊密連接阻力、改變緊密連接對流動物質(zhì)的選擇性，降低乳糖跨緊密連接彌散率;通過限制產(chǎn)生細胞因子和多形核粒細胞浸潤的炎癥反應(yīng)，減輕因其沿趨化梯度遷移引起小腸細胞間緊密連接阻力的降低。同時，與缺血再灌注損傷組相比，谷氨酰胺處理組的MDA水平顯著降低，SOD活力、GSH及GSHPx含量顯著升高，提示Gln可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機體清除氧自由基的能力。由此可見，Gln處理可以減低缺血再灌注損傷，上調(diào)occludin蛋白的表達，該保護作用可能是通過抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化而起作用的。但Gln的使用方法、劑量以及協(xié)同效應(yīng)等還需要進一步的探索研究，以徹底分析Gln對腸缺血再灌注損傷的作用機制，從而為臨床工作提供指導(dǎo)。

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Protective effects of glutamine pretreatment on occludin protein in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

WANG Ai－li，NIU Qiong，SHI Ning，JIA Xing－fang，LIU Cheng－xia

(Department of Gastroenterology，The Hospital Affiliated to Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China.E-mail: phdlcx@163.com)

AIM:To determine the effects of glutamine(Gln)pretreatment on occludin protein in the rats with intestinal ischemia－reperfusion(I/R)injury.METHODS:Male Wistar rats(n=30)were randomly divided into 3 groups(n=10):sham group，I/R group and Gln pretreatment group.The rats in Gln pretreatment group were pretreated with Gln at dose of 1 g·kg－1·d－1by orogastric route for 7 d，and those in the other 2 groups were pretreated with the same volume of normal saline.Intestinal I/R was induced by 30－min occlusion of the superior mesenteric artery followed by 24 h of reperfusion.After the operation，the levels of IL－10，IL－2，TNF－α，SOD and MDA were measured.The occludin protein was determined by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTS:The occludin protein level in I/R group was significantly lower than that in sham group and Gln group(P＜0.05).The levels of MDA and TNF－α in I/R group were significantly higher than those in sham group and Gln group(P＜0.05).The levels of SOD，IL－10 and IL－2 in I/R group were significantly lower than those in sham group and Gln group(P＜0.05).CONCLUSION:Glutamine has a protective effect on occludin protein in intestinal ischemia－reperfusion injury.The mechanism may be related to oxidative stress response and inflammatory inhibition.

Glutamine;Intestinal ischemia－reperfusion injury;Occludin;Inflammation;Oxidative stress

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.031

1000－4718(2015)02－364－05

2014－07－20

2014－12－03

山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2010HL051)

△通訊作者Tel:0543－3256725;E－mail:phdlcx@163.com