硫化氫保護(hù)被ATP損傷的PC12細(xì)胞*

馬　潔，沈　慧，王　璐，宋景貴，韓亞州，李東亮△(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，附屬中心醫(yī)院，第三附屬醫(yī)院，第二附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)00;沁陽(yáng)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南沁陽(yáng)0)

硫化氫保護(hù)被ATP損傷的PC12細(xì)胞*

馬潔1，2，沈慧1，3，王璐1，宋景貴4，韓亞州5，李東亮1△
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，2附屬中心醫(yī)院，3第三附屬醫(yī)院，4第二附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453003;5沁陽(yáng)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南沁陽(yáng)454550)

［摘要］目的:觀察硫化氫的供體硫氫化鈉( NaHS)對(duì)三磷酸腺苷( ATP)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力、胞內(nèi)Ca(2 +)濃度(［Ca(2 +)］i)及膜通透性的變化，探討硫化氫神經(jīng)保護(hù)作用的嘌呤信號(hào)機(jī)制。方法:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高分化的PC12細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，分別為( 1)正常對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行ATP處理; ( 2) ATP組:接種細(xì)胞24 h后ATP處理; ( 3) NaHS + ATP組: NaHS預(yù)先孵育30 min后再用ATP處理，并且NaHS始終存在于反應(yīng)體系中; ( 4) KN-62 ( P2X7受體阻斷劑) + ATP組: KN-62預(yù)先孵育30 min，其余同NaHS + ATP組。MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力，F(xiàn)ura-2/ AM熒光染料檢測(cè)各組［Ca(2 +)］i，檢測(cè)熒光染料YO-PRO-1的相對(duì)熒光單位以反映膜的通透性。結(jié)果: ( 1) 0. 3 mmol/L ATP對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，但1、3、5、10 mmol/L ATP則呈濃度依賴式明顯降低細(xì)胞活力，200 μmol/L NaHS干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)ATP引起的細(xì)胞活力下降( P＜0. 05)，而800 μmol/L NaHS預(yù)處理則加劇ATP對(duì)PC12細(xì)胞的損傷( P＜0. 05)。( 2) ATP處理PC12細(xì)胞會(huì)引起［Ca(2 +)］i迅速升高并且呈濃度依賴性，NaHS預(yù)處理能對(duì)抗ATP引起的［Ca(2 +)］i升高( P＜0. 05)。( 3)隨著ATP濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞內(nèi)YO-PRO-1的熒光強(qiáng)度顯著增加，NaHS預(yù)處理可明顯減少細(xì)胞對(duì)YO-PRO-1的攝取( P＜0. 05)。結(jié)論:硫化氫可保護(hù)ATP損傷的PC12細(xì)胞，可能與其抑制［Ca(2 +)］i升高和YO-PRO-1熒光增強(qiáng)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］三磷酸腺苷;硫化氫;嘌呤P2X7受體; PC12細(xì)胞

近年來(lái)三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP) -P2X嘌呤信號(hào)途徑在腦缺血-再灌注損傷中的作用逐漸受到關(guān)注，而對(duì)P2X7受體亞型的研究則成為焦點(diǎn)。在正常生理狀態(tài)下，ATP作用于P2X7受體并將其激活，引起Ca2 +和Na+內(nèi)流，K+外流，細(xì)胞去極化。而在腦缺血-再灌注損傷時(shí)，損傷的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的ATP［1］，這些高濃度的ATP持續(xù)地刺激P2X7受體，不僅使神經(jīng)元去極化的內(nèi)向電流振幅隨時(shí)間增強(qiáng)［2］，而且可形成大的“膜孔”，900 Da以下的各種物質(zhì)(如NMDG+、YO-PRO-1和ethidium)都可以自由通過(guò)［3］，此后進(jìn)一步引起活性氧、谷氨酸、ATP等炎性物質(zhì)的釋放及炎性體的生成，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，空泡形成，甚至凋亡和壞死，造成腦、神經(jīng)組織的繼發(fā)性損傷［4］。胞外高濃度的ATP是“死亡因子”的理念已經(jīng)被研究者普遍認(rèn)可，近年來(lái)的研究報(bào)道也相繼證實(shí)了ATP的損傷作用［5］。

關(guān)于硫化氫( hydrogen sulfide，H2S)抗缺血-再灌注損傷的機(jī)制目前有幾種說(shuō)法，如激活KATP通道說(shuō)、抑制興奮毒說(shuō)、抗氧化說(shuō)等。而本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果證實(shí)了ATP損傷PC12細(xì)胞與P2X7受體有關(guān)，本文則關(guān)注H2S對(duì)ATP損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制及其關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，試圖為H2S的臨床應(yīng)用提供一些實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料和方法

1細(xì)胞系和主要試劑

PC12細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

MTT、ATP、H2S供體硫氫化鈉( sodium hydrosulfide，NaHS)、P2X7受體阻斷劑KN-62和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Sigma; Fura-2/AM購(gòu)自Dojindo; YO-PRO-1 Iodide購(gòu)自Invitrogen;胎牛血清購(gòu)自HyClone。

2方法

2.1母液及工作液配制ATP用無(wú)菌三蒸水配成500 mmol/L的母液，NaHS用無(wú)菌三蒸水配成50 mmol/L的母液。KN-62用無(wú)菌DMSO配成1 mmol/ L的母液。上述各母液分裝后避光于－20℃保存，在使用前配成適宜濃度的工作液。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組PC12細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行，分為正常對(duì)照組( DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng))、ATP組(接種細(xì)胞24 h后用ATP處理)、NaHS + ATP組( NaHS孵育30 min后再用ATP處理，并且NaHS始終存在于反應(yīng)體系中)和KN-62 + ATP組( KN-62預(yù)先孵育30 min，其余同NaHS + ATP組)。

2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活力對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，稀釋為5×105/L密度的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板中。按照上述方法分組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，藥物按預(yù)定作用時(shí)間處理后，加入以PBS配制的濃度為5 g/L的MTT 10 μL，以上配液及加藥過(guò)程均需避光操作。37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后取出培養(yǎng)板，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)量各孔的吸光度( A)。根據(jù)下列公式計(jì)算各組細(xì)胞活力:活力( %) = ( A處理組－A空白組) /( A對(duì)照組－A空白組)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度( intracellular Ca2 +concentration，［Ca2 +］i)的測(cè)定取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以2 ×105/L的細(xì)胞密度接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，24 h后各組細(xì)胞按分組的描述進(jìn)行處理。5 μmol/L的Fura-2/AM孵育30 min后常規(guī)洗滌，HBSS孵育30 min，使用具有Ca2 +成像系統(tǒng)的熒光顯微鏡檢測(cè)ATP引起的［Ca2 +］i變化，［Ca2 +］i以340 nm熒光強(qiáng)度與380 nm熒光強(qiáng)度( F340/F380)的比值來(lái)計(jì)算。

2.5YO-PRO-1攝入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膜孔形成細(xì)胞膜孔形成時(shí)分子量為629 Da的YO-PRO-1可進(jìn)入細(xì)胞與核酸結(jié)合發(fā)出綠光，因此可根據(jù)熒光強(qiáng)度反映膜孔開放的程度。YO-PRO-1與ATP同時(shí)加入各組，使YO-PRO-1溶液的終濃度為2 μmol/L。37℃孵育1 h，此后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)516 nm)。YO-PRO-1熒光強(qiáng)度= A實(shí)驗(yàn)組/ A對(duì)照組×100%。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組細(xì)胞攝取的熒光強(qiáng)度定為100%。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( mean±SEM)表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ATP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的變化

以空白對(duì)照組細(xì)胞活力設(shè)為100%，0. 3、1、3、5 和10 mmol/L ATP作用3 h后，PC12細(xì)胞活力分別為98. 7%、87. 5%、83. 0%、80. 4%和72. 4%，除0. 3 mmol/L組與對(duì)照組無(wú)顯著差異外，其余各組細(xì)胞活力均明顯低于空白對(duì)照組( P＜0. 05)，且隨著ATP濃度增大，PC12細(xì)胞活力逐漸下降，見(jiàn)圖1。

2 NaHS對(duì)ATP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的影響

不同濃度NaHS預(yù)孵育PC12細(xì)胞半小時(shí)后再用ATP( 3 mmol/L)處理。以空白對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，ATP ( 3 mmol/L)組為83. 0%，50 μmol/L NaHS組為80. 0%，與ATP組相比無(wú)明顯差異; 200 μmol/L NaHS組為88. 4%，明顯高于ATP組( P＜0. 05) ; 800 μmol/L NaHS組為74. 2%，與ATP組相比反而下降( P＜0. 05)。由此表明濃度為200 μmol/ L的NaHS對(duì)ATP損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，但濃度為800 μmol/L的NaHS對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)為損傷作用，見(jiàn)圖1。

3 ATP處理對(duì)PC12細(xì)胞［Ca2 +］i的影響

Figure 1.The effects of NaHS on the viability of PC12 cells injured by ATP.Mean±SEM.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATP group.圖1　NaHS對(duì)ATP致傷PC12細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effects of different concentrations of ATP on［Ca2 +］iof PC12 cells.Mean±SEM.n = 20.＊＊P＜0. 01 vs control group.圖2　不同濃度ATP對(duì)PC12細(xì)胞［Ca2 +］i的影響

如圖2所示，加入1 mmol/L ATP后［Ca2 +］i輕微升高，與給藥前相比無(wú)明顯差異，但3 mmol/L ATP組［Ca2 +］i增加50%，顯著高于給藥前的基礎(chǔ)值( P＜0. 01)，5 mmol/L ATP組給藥后［Ca2 +］i增加66. 3%，也明顯高于給藥前( P＜0. 01)。結(jié)果提示一定濃度的ATP激活相應(yīng)的嘌呤受體后，可使［Ca2 +］i明顯增加，Ca2 +或許是嘌呤信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)傳遞的關(guān)鍵分子。

4 KN-62與NaHS抑制ATP介導(dǎo)的［Ca2 +］i增高

分別給予P2X7受體阻斷劑KN-62與NaHS處理PC12細(xì)胞均未引起［Ca2 +］i增加，表明單獨(dú)使用KN-62或NaHS并不能改變PC12細(xì)胞［Ca2 +］i，即KN-62與NaHS均不能激活P2X7受體。

而P2X7受體阻斷劑KN-62預(yù)孵育0. 5 h后再加入ATP( 3 mmol/L)，KN-62 + ATP組［Ca2 +］i增幅為14. 5%，明顯低于ATP( 3 mmol/L)組的50%增幅( P＜0. 01)，表明ATP介導(dǎo)的［Ca2 +］i增高與P2X7受體的激活有關(guān)。NaHS預(yù)孵育0. 5 h后再加入ATP ( 3 mmol/L)，NaHS + ATP組［Ca2 +］i增幅為21. 3%，也明顯低于ATP( 3 mmol/L)組的50% ( P＜0. 01)。表明NaHS有類似于KN-62下調(diào)ATP介導(dǎo)的［Ca2 +］i升高的作用。

若將NaHS和ATP同時(shí)加入，［Ca2 +］i增幅為42. 6%，與單純ATP( 3 mmol/L)處理組沒(méi)有顯著差異( P＞0. 05)。而NaHS預(yù)孵育0. 5 h后再加入ATP ( 3 mmol/L)，［Ca2 +］i為21. 3%，明顯低于ATP( 3 mmol/L)組( P＜0. 01)。表明NaHS存在于反應(yīng)體系的時(shí)間及與ATP加入的先后順序決定其作用的效果，0. 5 h的預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)ATP介導(dǎo)的［Ca2 +］i升高，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Inhibitory effects of KN-62 and NaHS on the increase in［Ca2 +］iinduced by ATP in PC12 cells.Mean±SEM.n = 20.＊＊P＜0. 01 vs ATP group;##P＜0. 01 vs NaHS + ATP group.圖3　KN-62與NaHS抑制ATP介導(dǎo)的PC12細(xì)胞［Ca2 +］i的升高

5 ATP對(duì)PC12細(xì)胞膜孔形成的影響

不同濃度的ATP作用于PC12細(xì)胞1 h后，細(xì)胞對(duì)YO-PRO-1的攝取量隨ATP濃度的增加而增強(qiáng)，3 mmol/L ATP在分別作用15、30和60 min后，PC12細(xì)胞對(duì)YO-PRO-1的攝取隨時(shí)間的延長(zhǎng)也明顯增強(qiáng)。表明ATP介導(dǎo)的PC12細(xì)胞膜孔形成既取決于ATP的濃度，又受到ATP作用時(shí)間長(zhǎng)短的影響，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effect of ATP on the uptake of YO-PRO-1 in PC12 cells.Mean±SEM.n =3.＊＊P＜0. 01 vs 0 mmol/L;##P＜0. 01 vs 15 min.圖4　ATP對(duì)PC12細(xì)胞YO-PRO-1攝入的影響

6 KN-62與NaHS抑制ATP介導(dǎo)的細(xì)胞膜孔形成

分別用KN-62和NaHS預(yù)孵育0. 5 h再加入ATP( 3 mmol/L)，如圖5所示，NaHS + ATP組與KN-62 + ATP組對(duì)YO-PRO-1的攝取都明顯弱于單純ATP( 3 mmol/L)組( P＜0. 01)，表明NaHS和KN-62 對(duì)ATP介導(dǎo)的細(xì)胞膜孔形成都有抑制作用。

Figure 5.The effects of KN-62 and NaHS on YO-PRO-1 uptake induced by ATP in PC12 cells.Mean±SEM.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group;##P＜0. 01 vs ATP group.圖5　KN-62和NaHS對(duì)胞外ATP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞攝入YO-PRO-1的影響

討論

PC12細(xì)胞是一種大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，在NGF誘導(dǎo)下其分化、生長(zhǎng)、生理功能等方面均類似于神經(jīng)元。用高濃度ATP處理PC12細(xì)胞，則類似于模擬體內(nèi)各種病理?xiàng)l件如缺血、炎癥、休克時(shí)損傷神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞釋放的大量ATP對(duì)病灶周圍正常神經(jīng)元產(chǎn)生的損傷。本文的實(shí)驗(yàn)表明0. 3 mmol/L ATP 對(duì)PC12細(xì)胞活力無(wú)影響，但隨ATP濃度的增加，PC12細(xì)胞的活力逐漸下降，傷亡的細(xì)胞也明顯增多，這些結(jié)果表明高濃度的ATP的確能造成神經(jīng)元損傷并死亡。NaHS對(duì)ATP致傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用與其濃度有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示200 μmol/L濃度的保護(hù)作用較佳，更高濃度800 μmol/L的NaHS卻對(duì)ATP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞起損傷作用。有文獻(xiàn)指出過(guò)量的H2S是細(xì)胞色素氧化酶的強(qiáng)抑制劑，能與線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的氧化型細(xì)胞色素氧化酶中的Fe3 +結(jié)合，抑制電子傳遞和氧的利用，引起細(xì)胞內(nèi)缺氧，造成細(xì)胞內(nèi)窒息［6］。孟金蘭等［7］也證實(shí)了在PC12細(xì)胞中，50～200 μmol/L NaHS可呈濃度依賴性促進(jìn)存活素表達(dá)，而800 μmol/L NaHS處理后存活素的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符合，都表明800 μmol/L NaHS對(duì)PC12細(xì)胞本身可能有損傷作用。

在真核細(xì)胞中，Ca2 +是一個(gè)非常重要的第二信使，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理生化反應(yīng)過(guò)程［8］。在生理情況下，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)健康細(xì)胞的生命活動(dòng)是非常必要的，胞內(nèi)Ca2 +的失調(diào)必將引起細(xì)胞損傷死亡。行妍妍等［9］提出了“鈣調(diào)整點(diǎn)”的假說(shuō)，認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制細(xì)胞神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，影響突觸傳遞、可塑性及神經(jīng)元的發(fā)育。然而，神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂(如腦缺血、低氧癥、低血糖癥、癲癇等)時(shí)，神經(jīng)元將受到異常刺激，細(xì)胞內(nèi)外的Ca2 +濃度發(fā)生波動(dòng)［10］。腦卒中發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)的糖酵解增加，使乳酸和酮體聚積，pH值降低，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，胞漿內(nèi)游離Ca2 +增多，線粒體膜電位降低，從而誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死［11］。30年前Chahwala等［12］報(bào)道了細(xì)胞外的ATP能夠引起Ca2 +、Na+內(nèi)流并使MEL細(xì)胞的活力下降。由此可見(jiàn)［Ca2 +］i增加會(huì)對(duì)細(xì)胞造成致命的損傷，維持［Ca2 +］i相對(duì)穩(wěn)定對(duì)細(xì)胞的正常生存具有深遠(yuǎn)的意義。

有研究表明體外活化P2X7受體需要細(xì)胞外ATP濃度≥1 mmol/L，而活化其它的P2受體需要ATP濃度＜100 μmol/L［13］，在我們實(shí)驗(yàn)中1 mmol/L ATP對(duì)PC12細(xì)胞［Ca2 +］i影響甚小，3、5 mmol/L ATP使［Ca2 +］i顯著升高，看來(lái)ATP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞［Ca2 +］i升高可能主要是通過(guò)激活細(xì)胞上的P2X7受體實(shí)現(xiàn)的。為證實(shí)這一觀點(diǎn)，我們進(jìn)一步使用P2X7受體特異性的阻斷劑KN-62預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能對(duì)抗ATP引起的［Ca2 +］i升高，從而也印證了上述觀點(diǎn)。NaHS與ATP同時(shí)加入培養(yǎng)體系，ATP引起的PC12細(xì)胞［Ca2 +］i升高的現(xiàn)象沒(méi)有被抑制，而NaHS預(yù)孵育0. 5 h后再加入ATP，［Ca2 +］i升高卻明顯被逆轉(zhuǎn)，表明NaHS預(yù)孵育可以抑制P2X7受體的激活，為NaHS臨床使用的適宜時(shí)間提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

通常P2X7受體作為陽(yáng)離子通道發(fā)揮作用，但是經(jīng)過(guò)反復(fù)或持續(xù)地暴露于高濃度的ATP時(shí)，可形成允許900 Da以下分子通透的“膜孔”［1］，膜孔的不斷增多導(dǎo)致細(xì)胞水腫，空泡形成、最終凋亡壞死。我們以分子量為629 Da的熒光物質(zhì)YO-PRO-1攝入水平作為膜孔形成的指標(biāo)，分別以不同濃度的ATP作用于PC12細(xì)胞，結(jié)果顯示隨ATP濃度的增高，細(xì)胞YO-PRO-1攝入水平也明顯增加。隨后我們用3 mmol/L ATP分別處理PC12細(xì)胞15 min、30 min、60 min，結(jié)果顯示隨ATP作用時(shí)間的延長(zhǎng)，YO-PRO-1進(jìn)入細(xì)胞也逐漸增多。以ATP作用15 min時(shí)PC12細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度為100. 0%，30 min時(shí)熒光強(qiáng)度增至112. 2%，1 h時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)138. 0%。總之，同一作用時(shí)間，提高ATP濃度會(huì)加速PC12細(xì)胞膜孔的形成;而同一ATP濃度作用，則隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，也會(huì)促進(jìn)膜孔的形成［14］。Auger等［15］在胸腺細(xì)胞中也證實(shí)了ATP持續(xù)地作用會(huì)促使膜孔形成，然后大分子的YO-PRO-1即進(jìn)入細(xì)胞，而P2X7受體特異性的阻滯劑o-ATP能明顯拮抗這一現(xiàn)象。在我們的實(shí)驗(yàn)中使用了另一種P2X7受體特異性阻滯劑KN-62，結(jié)果發(fā)現(xiàn)也能減少ATP引起的細(xì)胞對(duì)YO-PRO-1的攝取，為P2X7受體在ATP誘導(dǎo)的膜孔形成中的重要作用進(jìn)一步提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

細(xì)胞膜的通透性隨著ATP濃度改變發(fā)生了質(zhì)的變化，結(jié)果細(xì)胞膜上形成了大“膜孔”，大量小于900 Da的有機(jī)物質(zhì)自由進(jìn)出，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡而死亡。H2S抗損傷保護(hù)細(xì)胞的作用已經(jīng)在多個(gè)組織器官得到了證實(shí)［16］，H2S是否可通過(guò)調(diào)控膜孔的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)抗損傷而保護(hù)細(xì)胞呢?本實(shí)驗(yàn)用NaHS ( 200 μmol/L)預(yù)孵育30 min可顯著減少ATP誘導(dǎo)的YOPRO-1的攝取，減少PC12細(xì)胞對(duì)大分子的通透，減輕對(duì)PC12細(xì)胞的損傷，為NaHS調(diào)控膜孔激活觀點(diǎn)取得了初步證據(jù)。

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Protective effect of hydrogen sulfide on PC12 cells injured by ATP

MA Jie1，2，SHEN Hui1，3，WANG Lu1，SONG Jing-gui4，HAN Ya-zhou5，LI Dong-liang1
(1Department of Physiology and Neurobiology，2Affiliated Central Hospital，3The Third Affiliated Hospital，4The Second Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China;5Department of Neurology，Qinyang People’s Hospital，Qinyang 454550，China.E-mail: xyldl8@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To prove the purinergic signaling mechanism of the neuroprotective action of hydrogen sulfide by observing the effects of sodium hydrosulfide ( NaHS)，a donor of hydrogen sulfide，on the cell viability，intracellular Ca(2 +)concentration(［Ca(2 +)］i) and the change of membrane permeability in the PC12 cells injured by adenosine triphosphate ( ATP).METHODS: PC12 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into 4 groups.In control group，the cells were cultured without ATP treatment.In ATP group，the cells were treated with ATP after cultured for 24 h.In NaHS + ATP group，the cells were incubated with NaHS for 30 min before treated with ATP，and NaHS always existed in the reaction system.In KN-62 + ATP group，the cells were pretreated with KN-62 for 30 min，and the other treatments were as the same as those in NaHS + ATP group.The cell viability was assessed by MTT assay.The［Ca(2 +)］iwas detected by Fura-2/AM staining.The membrane permeability was observed by staining with fluorescent dye YO-PRO-1.RESULTS: ATP at concentration of 0.3 mmol/L showed no injury effect on the cells.However，the cell viability was dropped gradually in a dose-dependent manner as the ATP at doses of 1，3，5 and 10 mmol/L.The decline of cell viability by ATP was obviously reversed by 200 μmol/L of NaHS in the PC12 cells ( P＜0. 05)，but exasperated by 800 μmol/L of NaHS ( P＜0. 05).At the same time，ATP evoked the increase in［Ca(2 +)］iin a dose-dependent manner，which was inhibited by NaHS ( P＜0. 05).Furthermore，the YO-PRO-1 uptake induced by ATP in a dose-dependent and time-dependent manner was also reduced by NaHS ( P＜0. 05).CONCLUSION: Hydrogen sulfide has protective effect on the PC12 cells injured by ATP.The mechanism may be related to the reverse of the increased［Ca(2 +)］iand YO-PRO-1 uptake.

［KEY WORDS］Adenosine triphosphate; Hydrogen sulfide; Purinergic P2X7receptor; PC12 cells

通訊作者△Tel: 0373-3029104; E-mail: xyldl8@126.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.81371346; No.81271376) ;新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2013年度研究生科研創(chuàng)新支持計(jì)劃資助項(xiàng)目( No.YJSCX201318Y)

［收稿日期］2014-10-22［修回日期］2015-03-02

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1231-06

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.014