家蠶蛾吐出液溶繭酶的溶栓作用研究

王乃紅宋麗新靳月琴李文利

（1山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院，山西運(yùn)城 044000；2大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧盤錦 124211）

家蠶蛾吐出液溶繭酶的溶栓作用研究

王乃紅1宋麗新2靳月琴1李文利2

（1山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院，山西運(yùn)城 044000；2大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧盤錦 124211）

利用CM?Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析從家蠶蛾吐出液中收集得到溶繭酶。通過精氨酸酯酶活力測(cè)定其酶活力為11.92 U／mg，利用纖維蛋白原降解試驗(yàn)和纖維蛋白平板試驗(yàn)初步驗(yàn)證其具有溶栓作用。小鼠腹部皮膚皮內(nèi)注射家蠶蛾吐出液溶繭酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)每公斤體質(zhì)量注射的酶劑量為0.25 μg／μL時(shí)，開始出現(xiàn)溶血；在小鼠體內(nèi)溶栓試驗(yàn)中，每公斤小鼠體質(zhì)量注射家蠶蛾吐出液溶繭酶的劑量分別為0（對(duì)照）、100、200、300、400 μg時(shí)，48 h后小鼠尾部血栓比例呈逐漸減小的趨勢(shì)，去除率分別為（5.00±0.41）%、（16.67±0.21）%、（37.97± 0.74）%、（49.15±0.65）%、（74.67±0.62）%。

家蠶蛾；吐出液；溶繭酶；溶栓作用

血栓是導(dǎo)致世界各地心腦血管疾病患者發(fā)病率和死亡率較高的原因之一［1］。臨床應(yīng)用的藥物可分為抗栓藥物和溶栓藥物兩大類，其中抗血栓藥物又可分為抗凝血藥和抗血小板凝集藥。目前，可以直接降解纖維蛋白的藥物，如血纖維蛋白溶酶和蛇毒纖溶酶等越來越引起人們的關(guān)注，并試圖通過研究增加其溶栓療效和減少出血。Meiser等［2］從大椎蝽（Panstrongylus megistis）的下顎腺中分離得到一種具有纖溶活性的類胰蛋白酶［1］，這表明一些昆蟲的吐出液或許可以成為潛在的溶栓劑。

家蠶蛹羽化時(shí)蛾的吐出液能濕潤(rùn)繭層，溶解絲膠蛋白及部分絲素蛋白，使繭層松解，進(jìn)而有助于蠶蛾撥開繭絲鉆出蠶繭［3］。早在1966年，美國(guó)學(xué)者Fotis等［4］研究發(fā)現(xiàn)某些營(yíng)封閉繭的昆蟲，在成蟲階段分泌的吐出液中含有一種酶，這種酶的水解底物不只局限于絲膠，它是一種更具廣泛性的蛋白水解酶，因此將其命名為溶繭酶（Cocoonase）。目前，溶繭酶的應(yīng)用前景主要在繅絲工業(yè)中酶法脫膠、化妝品工業(yè)中酶法水解絲以及血栓治療藥物的開發(fā)［5］。雖然研究人員對(duì)多種溶繭酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究［4，6］，但是對(duì)家蠶溶繭酶的溶血栓作用尚未見報(bào)道。

本研究從家蠶蛾吐出液中分離得到了家蠶溶繭酶，并測(cè)定了其精氨酸酯酶活性；通過纖維蛋白降解、小鼠體內(nèi)溶栓等一系列試驗(yàn)證實(shí)，家蠶蛾吐出液中的溶繭酶具有溶栓功能，為新型溶栓藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶蛹，蠶品種為871×872，由山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院提供；SPF級(jí)健康雄性昆明種小鼠，由大連醫(yī)科大學(xué)提供；CM－Sepharose Fast Flow（SPFF），購(gòu)自GE公司；蛋白質(zhì)分子量（低）標(biāo)準(zhǔn)、N－苯?；璍－精氨酸乙酯（BAEE）、人纖維蛋白原、纖維蛋白、角叉菜膠、凝血酶，購(gòu)自Sigma公司；AKTA explorer，購(gòu)自美國(guó)Phamacia biotech公司；酶標(biāo)儀（英國(guó)），購(gòu)自Thermo scientific公司；紫外分光光度計(jì)（V－560），購(gòu)自日本JASCO公司；ECP3000蛋白電泳儀、電泳槽，購(gòu)自北京六一設(shè)備廠。

1.2 家蠶蛾吐出液溶繭酶的分離純化

參照參考文獻(xiàn)［7］的方法收集家蠶蛾吐出液，即將發(fā)育到后期的蠶蛹頭朝下置于用塑料膜卷成的三角錐內(nèi)，將三角錐倒立，插入1.5 mL離心管中，繼續(xù)在室溫培養(yǎng)；在蠶蛹羽化過程中收集家蠶蛾吐出液，置于－80℃貯存?zhèn)溆谩M?Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析：將收集的家蠶蛾吐出液12 000 r／min離心，15 min后收集上清液，用50 mM NaAC?HAC（醋酸—醋酸鈉緩沖液）pH 5.8上樣緩沖液稀釋。先用雙蒸水清洗離子交換柱，流速為1.0 mL／min，然后用A溶液（NaAc 1.361 g，加入400 mL雙蒸水，用HAc調(diào)pH值至6.0，定容至500 mL；以下相同）平衡離子交換柱，待電導(dǎo)率持平時(shí)，將待純化樣品注入5.0 mL上樣環(huán)，開始進(jìn)樣，流速為0.5 mL／min。上樣完畢后，用A溶液再平衡離子交換柱，此過程中收集穿透峰流出液，待穿透峰和電導(dǎo)率再次持平后，用B溶液（NaAc 1.361 g、NaCl 29.250 g，加入400 mL雙蒸水，用HAc調(diào)節(jié)pH值至6.0，定容至500 mL；以下相同）進(jìn)行線性洗脫，濃度由0逐漸增大至50%，收集洗脫峰流出液，分別將穿透峰和洗脫峰進(jìn)行SDS?PAGE電泳，并測(cè)定其酰胺酶活性。

1.3 Lowry法蛋白定量

試驗(yàn)采用Lowry法［8］對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.3.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 （1）用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白配制成100 μg／mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，在96孔板上取11孔，按照表1平衡操作。（2）取24 μL A溶液和1.2 mL B溶液，混勻。各孔加入100 μL混合液，混勻，室溫靜置10 min。（3）各孔加入10 μL Folin－酚試劑，迅速混勻，室溫靜置30 min。（4）在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔吸光值（A750nm）。以各孔A750nm值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的蛋白濃度為橫坐標(biāo)，作圖。

表1 標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白配制表

1.3.2 家蠶蛾吐出液溶繭酶蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 根據(jù)1.3.1的方法，將家蠶蛾吐出液溶繭酶溶液用雙蒸水溶解稀釋10倍，測(cè)定純化后的家蠶蛾吐出液溶繭酶濃度，根據(jù)下式計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)濃度。

樣品蛋白質(zhì)濃度（μg／mL）＝樣品孔A750nm值的平均值對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度×樣品稀釋倍數(shù)

1.4 家蠶蛾吐出液溶繭酶中酰胺酶活力的測(cè)定

家蠶蛾吐出液溶繭酶中的酰胺酶活力的測(cè)定，采用合成底物苯甲酰－L－精氨酸乙酯鹽酸鹽（BAEE）法［9］。按1∶1比例加入BAEE底物溶液和50 mM Tris－HCl pH 8.0緩沖液，混勻后用作空白對(duì)照。取稀釋10倍的酶液200 μL，加入到2.8 mL 0.5 mM BAEE底物溶液中，混勻后在253 nm處測(cè)其吸光值。酶活力單位計(jì)算如下：以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，253 nm下的吸光值（A253nm）為縱坐標(biāo)作圖，在直線上任意2個(gè)時(shí)間點(diǎn)與相應(yīng)的光吸收值做差（△A253nm）。BAEE酶的活力定義為在25℃下，每分鐘內(nèi)酶作用于底物所產(chǎn)生的吸光度增加0.001為1個(gè)活力單位（U）。酶活力單位計(jì)算公式如下。

1.5 家蠶蛾吐出液溶繭酶對(duì)纖維蛋白原和纖維蛋白的降解

1.5.1對(duì)纖維蛋白原的降解 取500 μL 0.2%纖維蛋白原溶液于1.5 mL離心管，加入50 μL純化后的酶液，37℃溫育。分別在2、4、6、8、10、12、24 h從反應(yīng)體系中取出40 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer（3.1 mL 1M Tris－HCl（pH6.8）＋65 mL 50%甘油＋0.5 mL 1%溴酚蘭＋1.4 mL水），煮沸8 min終止反應(yīng)。取未進(jìn)行反應(yīng)的纖維蛋白原溶液做對(duì)照與上述處理過的樣品分別進(jìn)行SDS?PAGE電泳，觀察反應(yīng)情況。

1.5.2 對(duì)纖維蛋白的降解 取5 mL 1%瓊脂糖凝膠煮化后冷卻，加入5 mL 0.4%人纖維蛋白原溶液混勻，再加入0.2 mL人凝血酶（100 U／mL）（0.1 mol／L HAC／NaAC，pH8.0）混勻，倒入一個(gè)10 cm Petri平皿中，室溫靜置1 h，打孔。加15 μL純化后的酶溶液于平板上，37℃孵育24 h，并觀察水解圈的大小。依據(jù)此法，觀測(cè)到的清晰透明區(qū)域，即為纖維蛋白被水解的區(qū)域［10］。根據(jù)溶解面積的大小來確定家蠶蛾吐出液溶繭酶的纖溶活性強(qiáng)弱。

1.6 金屬離子對(duì)纖維蛋白原降解的影響

取0.2%纖維蛋白原200 μL加入到7個(gè)1.5 mL的離心管中，分別加入純化后的酶液20 μL及各種終濃度為10 mM的金屬離子Cu2＋、Mg2＋、Ca2＋、K＋、Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋，對(duì)照組中分別加入0.2%纖維蛋白原200 μL和純化后的酶液20 μL，37℃溫育。分別在4 h和24 h從反應(yīng)體系中取出50 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer，煮沸8 min終止反應(yīng)。取上述處理過的樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，與未進(jìn)行反應(yīng)的纖維蛋白原溶液對(duì)比，觀察反應(yīng)情況。

1.7 蛋白酶抑制劑對(duì)纖維蛋白原降解的影響

取0.2%纖維蛋白原200 μL和純化后的酶液20 μL，分別加入到7個(gè)1.5 mL的離心管中，依次加入終濃度為10 mM的DTT、EDTA、β－巰基乙醇、咪唑和1 mM、0.1 mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），對(duì)照組中分別加入0.2%纖維蛋白原200 μL和純化后的酶液20 μL，37℃溫育。分別在4 h和24 h從反應(yīng)體系中取出50 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer，煮沸8 min終止反應(yīng)。取上述處理過的樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，與未進(jìn)行反應(yīng)的纖維蛋白原溶液對(duì)比，觀察反應(yīng)情況。

1.8 出血活性試驗(yàn)

根據(jù)Kondo等［11］的方法，分別將不同劑量的家蠶蛾吐出液溶繭酶（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50 μg／μL）通過皮內(nèi)注射的方法分別注入到小鼠（每公斤體質(zhì)量注射18～22 g）的腹部皮膚中，對(duì)照組則注射100 μL生理鹽水，2 h后，剝離小鼠背部皮膚，觀察是否存在出血點(diǎn)及出血點(diǎn)直徑的大小。

1.9 體內(nèi)溶栓試驗(yàn)

1.9.1 小鼠尾靜脈血栓模型的建立 在小鼠腰背部皮下注射0.2%角叉菜膠溶液100 μL／只，小鼠尾尖4～24 h期間出現(xiàn)暗紅色血栓形成區(qū)，逐漸向尾根部擴(kuò)大到一定范圍，48～72 h后，經(jīng)紫色變黑色，與正常尾部分界明顯。

1.9.2 給藥方法 將50只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組（n＝10）。給對(duì)照組注射生理鹽水100 μL，其余4組小鼠按每公斤體質(zhì)量分別注射400、300、200、100 μg家蠶蛾吐出液溶繭酶，72 h后測(cè)量血栓形成的長(zhǎng)度［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶蛾吐出液溶繭酶的分離純化

通過AKTA純化系統(tǒng)，利用CM－Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析分離純化家蠶蛾吐出液，NaCl濃度為0.3 M洗脫后發(fā)現(xiàn)單一洗脫峰，分別對(duì)洗脫峰和穿透峰進(jìn)行酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該洗脫峰的蛋白具有精氨酸酯酶活性，SDS－PAGE電泳檢測(cè)（圖1）分析，蛋白條帶為2條，經(jīng)分析家蠶蛾吐出液溶繭酶信號(hào)肽的分子量為3.6 kD，此峰中的2種蛋白可視為同種蛋白質(zhì)，冷凍干燥保存。

圖1 家蠶溶繭酶分離純化SDS－PAGE電泳結(jié)果

2.2 Lowry法蛋白定量

試驗(yàn)采用Lowry法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，在750 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蛋白的吸光值，以A750nm值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。同時(shí)將待測(cè)樣品稀釋至一定倍數(shù)，使其吸光值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品蛋白濃度為745 μg／mL。

圖2 Lowry法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 酰胺酶活力測(cè)定

圖3 BAEE酶活力測(cè)定曲線

2.4 家蠶蛾吐出液溶繭酶對(duì)纖維蛋白原及纖維蛋白的降解

圖4 家蠶蛾吐出液溶繭酶對(duì)纖維蛋白原（A）及纖維蛋白（B）的降解

將家蠶蛾吐出液溶繭酶與人纖維蛋白原混勻，37℃反應(yīng)條件下，分別在2、4、6、8、10、12、24 h從反應(yīng)體系中取出40 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer煮沸后SDS－PAGE電泳分析（圖4）。纖維蛋白原的3條鏈，Aα?鏈的分子量為63.5 kD，Bβ?鏈的分子量為56.0 kD，γ?鏈的分子量為47.0 kD。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，纖維蛋白原的3條鏈逐漸被降解，其中優(yōu)先降解Aα?鏈和Bβ?鏈，而對(duì)γ?鏈的降解則較緩慢（圖4－A）。利用凝血酶的作用纖維蛋白原被降解成纖維蛋白，在平板內(nèi)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，家蠶溶繭酶平板明顯出現(xiàn)透明圈（圖4－B），說明家蠶蛾吐出液溶繭酶可以較好地降解纖維蛋白。

2.5 金屬離子對(duì)纖維蛋白原降解的影響

將各金屬離子（Cu2＋、Mg2＋、Ca2＋、K＋、Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋）按照終濃度10 mM加入到家蠶蛾吐出液溶繭酶與纖維蛋白原混合液中，37℃水浴，分別在4 h和24 h取樣，SDS－PAGE電泳檢測(cè)此降解作用的影響實(shí)驗(yàn)（圖5－A、B）表明，Mg2＋、Ca2＋、K＋幾乎對(duì)酶的活性沒有影響，而這3種離子正是金屬蛋白酶活性所必需的；因此，可以證明家蠶蛾吐出液溶繭酶是非金屬蛋白酶。

圖5 金屬離子對(duì)家蠶蛾吐出液溶繭酶降解纖維蛋白原的影響

2.6 蛋白酶抑制劑對(duì)纖維蛋白原降解的影響

將PMSF、咪唑、EDTA、β－巰基乙醇、DTT等酶抑制劑分別與酶液混合，使抑制劑終濃度為10 mM，37℃水浴4 h后SDS－PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可知PMSF在2個(gè)劑量下均對(duì)酶活性產(chǎn)生較大的影響，而PMSF是典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑；因此，家蠶蛾吐出液溶繭酶屬于絲氨酸蛋白酶家族；另外，金屬螯合劑EDTA對(duì)酶的活性也無太大的影響，更加說明溶繭酶不屬于金屬蛋白酶的范疇。2.7 小鼠腹部皮膚出血活性試驗(yàn)

圖6 抑制劑對(duì)家蠶溶繭酶降解纖維蛋白原的影響（4 h）

利用小鼠腹部皮膚皮內(nèi)注射的方法，每公斤體質(zhì)量注入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50 μg／μL不同劑量的家蠶蛾吐出液溶繭酶18～22 g，2 h后在注射點(diǎn)剝離周圍的皮膚觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠每公斤體質(zhì)量注射的酶劑量為0.25 μg／μL時(shí)，開始出現(xiàn)溶血，直徑約為5 mm，當(dāng)劑量升高至0.50 μg／μL時(shí)，溶血直徑達(dá)9 mm左右（圖7）。

圖7 小鼠腹部皮膚出血活性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 小鼠體內(nèi)溶栓試驗(yàn)

家蠶蛾吐出液溶繭酶在體內(nèi)的溶栓效果通過角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓模型來表征，給藥24 h和48 h后，不同劑量下小鼠尾部血栓長(zhǎng)度，占小鼠尾巴出現(xiàn)血栓長(zhǎng)度的比例均有明顯的降低，且隨著劑量的增大，溶栓率明顯增高；當(dāng)給小鼠每公斤體質(zhì)量注射家蠶蛾吐出液溶繭酶分別為400、300、200、100、0（對(duì)照）μg，給藥48 h后的結(jié)果顯示（圖8），給小鼠每公斤體質(zhì)量注射400 μg家蠶蛾吐出液溶繭酶時(shí)的溶栓效率最大，去除率為（74.67±0.62）%；當(dāng)給小鼠每公斤體質(zhì)量注射劑量為300、200、100 μg時(shí)，去除率分別為（49.15±0.65）%、（37.97±0.74）%和（16.67± 0.21）%，而對(duì)照組的去除率僅為（5.00±0.41）%。

圖8 角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓模型體內(nèi)溶栓結(jié)果（x±s）

3 討論

對(duì)溶繭酶的研究多集中于20世紀(jì)60、70年代，包括對(duì)家蠶、印度柞蠶和多音天蠶等鱗翅目昆蟲溶繭酶的研究［13］。然而對(duì)這幾種昆蟲的溶繭酶作用的研究也多集中于酶學(xué)性質(zhì)的研究，如吐出器官的研究、精氨酸酯酶活力、絲氨酸或胰蛋白酶抑制劑對(duì)溶繭酶及其前體免疫沉淀反應(yīng)的影響等等，但對(duì)溶繭酶溶栓效果的研究較少。

本試驗(yàn)利用CM－Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析分離純化出家蠶蛾吐出液溶繭酶。這種酶具有精氨酸酯酶活力，屬于絲氨酸蛋白酶家族、且為非金屬酶；但Cu2＋、Fe2＋和Zn2＋對(duì)酶活性均有不同程度的抑制作用，其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。該蛋白酶活性還可被半胱氨酸還原性變性劑DTT顯著抑制，推測(cè)可能是由于酶的二硫鍵遭到破壞，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合，最終使酶活力下降。家蠶蛾吐出液溶繭酶首先降解纖維蛋白原的Aα－鏈和纖維蛋白原的Bβ－鏈，然后才降解纖維蛋白原的γ－鏈，初步證明了家蠶蛾吐出液溶繭酶具有溶栓作用。通過在小鼠體內(nèi)的溶栓實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了這種溶栓作用。在出血活性安全的范圍內(nèi)，通過角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓模型溶栓發(fā)現(xiàn)，當(dāng)注射劑量逐漸增大時(shí)，小鼠尾部血栓長(zhǎng)度占整個(gè)尾巴長(zhǎng)度的比例也逐漸降低，當(dāng)小鼠每公斤體質(zhì)量注射400 μg時(shí)，去除率為（74.67±0.62）%，說明家蠶蛾吐出液溶繭酶具有良好的溶栓效果。但是，其具體的作用機(jī)制尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。

全球每年因腦血栓、腦梗塞、心肌梗塞、冠心病、動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病奪走1 200萬人的生命，接近世界總死亡人數(shù)的1／4，成為人類健康的頭號(hào)大敵［14］。目前治療血栓的方法主要有外科手術(shù)法和藥物治療等，其中外科手術(shù)雖然可較快去除血栓，但危險(xiǎn)性較大，適用于一些危機(jī)或突發(fā)狀況；藥物治療則相對(duì)比較容易被人們所接受。目前治療血栓的藥物一般具有抗原性且半衰期短，使其應(yīng)用給人們帶來較大的風(fēng)險(xiǎn)。另外，蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的活性物質(zhì)，對(duì)人體的健康具有很大的作用，它具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、降血壓和降血脂等生理功能［6］。因此，家蠶蛾吐出液溶繭酶的水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的活性物質(zhì)及其強(qiáng)烈的纖溶酶活力，在降血糖、降膽固醇及治療血栓等方面將會(huì)發(fā)揮很大作用。

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S881.2

A

1007－0982（2015）04－0048－06

2015－02－04；接受日期：2015－05－20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)CARS－22）；山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)20120311025－3）。

王乃紅（1964—），男，山西芮城，本科，高級(jí)農(nóng)藝師。

Tel：13466945998，E?mail：wnh＿1964＠163.com

李文利，男，副教授。

Tel：13342277088，E?mail：biolwl＠dlut.edu.cn