蘆丁片劑藥學(xué)綜合性實驗的流程及方法研究

陳 莉，杜紅麗，曾仁韜，張葉葉，魯 瑩，蔡國君（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433）

?研究報告?

蘆丁片劑藥學(xué)綜合性實驗的流程及方法研究

陳 莉，杜紅麗，曾仁韜，張葉葉，魯 瑩，蔡國君（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433）

目的以蘆丁為模型藥物，探討新藥片劑制備及藥效學(xué)評價的多學(xué)科綜合性實驗流程和方法。方法 采用薄層色譜定性鑒別槐米中的蘆丁成分；采用高效液相色譜法測定槐米中蘆丁含量及蘆丁精制品的含量；采用紫外分光光度法測定蘆丁片含量；采用離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張實驗考察蘆丁的藥效；利用粉末直接壓片法制備蘆丁片劑。結(jié)果與結(jié)論 本實驗完成了槐米的質(zhì)量評價，槐米中蘆丁的提取純化、含量測定，蘆丁藥效學(xué)考察及蘆丁片處方工藝研究等內(nèi)容，提高了實驗操作技能，實踐了蘆丁臨床前研究的部分內(nèi)容。

多學(xué)科綜合性實驗；蘆?。凰幮W(xué)；片劑

蘆丁（rutin）又名蕓香苷、維生素P，是一種典型的黃酮類化合物，幾乎所有的蕓香科和石楠科植物中均含有蘆丁，尤其是在蕓香科的蕓香草、豆科植物的槐米中，蘆丁含量較為豐富，可用作提取蘆丁的原料［1-3］。蘆丁作為一種重要的中藥化學(xué)成分，具有較強(qiáng)的藥理活性且毒性低。蘆丁具有降低毛細(xì)血管通透性和脆性，促進(jìn)細(xì)胞增生和防止血細(xì)胞凝聚，以及抗炎、降血脂等方面的作用［4，5］。蘆丁在水中的溶解度較小，在胃腸道內(nèi)易被破壞，因此限制了其臨床應(yīng)用。隨著現(xiàn)代制劑研究的發(fā)展，改進(jìn)了蘆丁的劑型，使其溶解度和生物利用度均有所提高［6，7］。第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士研究生以4人為一組，查閱文獻(xiàn)、制訂實驗方案、實施實驗、整理數(shù)據(jù)，以蘆丁為模型藥物模擬新藥研究流程，完成了蘆丁片劑制備及藥效學(xué)評價的研究內(nèi)容。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；ALC-210.4艾科勒分析天平（萬分之一精度，

德國賽多利斯集團(tuán)）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（埃德儀器國際貿(mào)易有限公司）；紫外分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；溶出測定儀（富科思科技）；M 10039小型單沖壓片機(jī)（上海天和制藥機(jī)械有限公司）等。

1.2 試劑 蘆丁對照品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，含量≥98%；去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）購自Sig-ma公司；羥丙基甲基纖維素（HPMC）、微晶纖維素（MCC）、可壓性淀粉、硬酯酸鎂均為藥用規(guī)格；乙腈、冰醋酸為色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水，其他試劑為分析純。

1.3 實驗動物 雄性SD大鼠，體重（200±10）g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 槐米的質(zhì)量評價

2.1.1 性狀觀察 原藥材（生槐米）呈橢圓形，長2～4 mm，直徑約2mm，花萼下部有數(shù)條縱紋，花萼上方為未開放的花瓣，花梗細(xì)小，體輕，氣微，符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱：藥典）規(guī)定。

2.1.2 顯微鑒別 本品粉末呈黃綠色，在顯微鏡下可觀察到類球形或鈍三角形的花粉粒，非腺毛及簇狀草酸鈣方晶，符合藥典規(guī)定。

2.1.3 理化鑒別 取生槐米粗粉1.002 g，置于50 m l錐形瓶中，加入甲醇25 m l，超聲提取10 min，過濾，即得供試品溶液。

取供試品溶液1 m l，進(jìn)行鹽酸-鎂粉反應(yīng)，溶液變成紅色，說明提取物中可能含黃酮類化合物；另取供試品溶液1 m l進(jìn)行Molish反應(yīng)，產(chǎn)生紫色圓環(huán)，說明提取物中可能含糖。

另取蘆丁對照品，加甲醇制成每1 m l含4 mg的溶液作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1），展開，取出，晾干后噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后置于紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，兩者的比移值均為Rf＝0.31，說明槐米中存在蘆丁。

2.1.4 槐米中蘆丁的含量測定 取槐米0.100 4 g，置于100 m l具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 m l，稱量。超聲處理30 min，放冷，稱量并用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液1 m l，置于10 m l量瓶中，加流動相至刻度，搖勻即得供試品溶液。精密稱取蘆丁對照品50 mg，置于100 m l容量瓶中，加甲醇溶解，定容；再精密量取1 m l置于10 m l量瓶中，用流動相稀釋并定容，得到濃度約為50μg／m l的對照品溶液。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Spherisorb ODS2 C18柱，250 mm×4.6 mm，5.0μm）；以乙腈-冰醋酸-水（20∶4∶80）為流動相；檢測波長為257 nm。理論板數(shù)按蘆丁峰計算應(yīng)不低于2 000。分別精密吸取對

照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中有與蘆丁保留時間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計算，槐米中含蘆丁15.92%，符合藥典規(guī)定的槐米中蘆丁含量不低于15%的要求。

2.2 槐米中蘆丁的提取與精制 稱取20.02 g的槐米置于燒杯中，加入200 m l開水，直火加熱至使其沸騰，30 m in后趁熱濾過，重復(fù)3次。每次趁熱濾過并合并濾液后靜置。48 h后抽濾，用蒸餾水洗濾渣得到蘆丁粗制品。之后將其置于圓底燒瓶中，加200 m l工業(yè)乙醇冷凝回流20m in，趁熱抽濾。濾液于65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50 m l左右，然后將其倒入燒杯中冷卻析晶，最后進(jìn)行抽濾及干燥，得蘆丁精制品，稱重為1.91 g。

2.3 蘆丁精制品的含量測定 精密稱取蘆丁精制品50 mg，置于100 m l容量瓶中，加甲醇溶解定容；再精密量取1m l，置于10m l容量瓶中，用流動相稀釋并定容，得供試品溶液（按此步驟配制3份，并于進(jìn)樣前用微孔濾膜過濾）。精密稱取蘆丁對照品50 mg，置于100 m l容量瓶中，加甲醇溶解，定容；再精密量取1 m l置于10 m l容量瓶中，用流動相稀釋并定容，得濃度約為50μg／m l的對照品溶液。按照“2.1.4”項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算，蘆丁含量為89.02%。故蘆丁提取率為53.35%，計算公式如下：

2.4 蘆丁藥效學(xué)實驗 斷頭處死大鼠，迅速取胸主動脈，置于通以95%O2和5%CO2混合氣體的K-H液中，小心去除周圍結(jié)締組織后將血管剪成2～3 mm寬的血管環(huán)，避免過度牽拉，以防損傷內(nèi)皮。將血管環(huán)放入含K-H液的浴槽內(nèi)，調(diào)節(jié)靜息張力，在37℃下穩(wěn)定一段時間。

用Ach檢驗血管內(nèi)皮活性：待動脈環(huán)穩(wěn)定后，換液1次，浴槽中加入10μmol／L的NE，收縮達(dá)峰值15 m in后，加入10μmol／L的Ach，若加Ach后使NE預(yù)收縮的血管舒張60%～90%，可認(rèn)為內(nèi)皮完整；反之，則認(rèn)為內(nèi)皮被破壞。

NE（10μmol／L）預(yù)收縮達(dá)穩(wěn)態(tài)后，加入蘆丁對照品，使灌流液中藥物濃度達(dá)80μmol／L。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組之間的比較采用非成對的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果見圖1，與對照組相比，加入NE后，血管張力明顯升高，說明主動脈環(huán)收縮；與NE組相比，加入蘆丁使血管張力明顯下降，說明主動脈環(huán)舒張。證明蘆丁對離體大鼠的胸主動脈環(huán)可能有舒張作用。

圖1 蘆丁對主動脈環(huán)張力的影響（n＝4）

2.5 蘆丁片劑的制備與評價 采用粉末直接壓片法，蘆丁片劑的處方量見表1。稱取蘆丁及各種輔料，分別過80目篩，混勻，粉末直接壓制成10 mm片劑，預(yù)計得到蘆丁含量為40mg／片的片劑。制得的片劑表面光潔、色澤均勻一致、無雜質(zhì)、無異物（圖2）。

表1 蘆丁片劑處方（100片）

圖2 蘆丁片劑外觀

2.6 蘆丁片劑的檢查

2.6.1 片重差異 隨機(jī)精密稱定20片蘆丁片，計算平均片重，片重差異＜5.1%，符合藥典規(guī)定。

2.6.2 硬度 隨機(jī)取6片，用片劑四用測定儀測定，其平均硬度為（490±50）kPa。

2.6.3 蘆丁含量 取20片制備好的蘆丁片劑，充分研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（相當(dāng)于蘆丁10 mg），置于50 m l量瓶中，加入適量甲醇，振蕩，使蘆丁溶解，繼續(xù)加入甲醇稀釋并定容至刻度，濾紙濾過，取續(xù)濾液1.3 m l，用甲醇定容至25 m l量瓶中，得供試品溶液。精密稱取蘆丁對照品10 mg于50 m l量瓶中，甲醇定容；再從中取1.3 m l置于25 m l量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，得到濃度約為10.4μg／m l的對照品溶液。選擇257 nm為測定波長，用紫外分光光度計測定供試品、對照品溶液的吸光度。按外標(biāo)法以吸光度計算，蘆丁含量表示為標(biāo)示量的百分含量，為95.86%。

2.6.4 釋放度 采用籃法，溶出介質(zhì)為新鮮蒸餾水，約900 m l；溫度37℃；轉(zhuǎn)速100 r／min；取樣品6片，分別放入籃中，從轉(zhuǎn)籃降入容器立即開始計時。選取時間點為1、2、4、6、8、10、12 h。吸取溶液適量，立即過濾，精密量取續(xù)濾液1.3 m l置于25 m l量瓶中，甲醇稀釋定容，得供試品溶液。精密稱取蘆丁對照品10 mg于50 m l量瓶中，甲醇定容；再從中精密量取1.3 m l置于25 m l量瓶中，甲醇稀釋定容，得濃度約為10.4μg／m l的對照品溶液。取適量供試品溶液、對照品溶液測定吸光度。按外標(biāo)法以吸光度計算平均累積溶出百分比（%），結(jié)果見圖3。

圖3 12 h內(nèi)蘆丁片劑平均累積溶出率

3 討論

3.1 文獻(xiàn)檢索 文獻(xiàn)的可行性及真實性會影響實驗方案的設(shè)計。例如，在查閱有關(guān)蘆丁藥理學(xué)方面的文獻(xiàn)時，宋必衛(wèi)等［8］介紹蘆丁有鎮(zhèn)痛作用，但是該文發(fā)表時間較為久遠(yuǎn)并且之后未見有類似報道，實驗的可操作性和可重復(fù)性可能存在問題，盡管鎮(zhèn)痛實驗操作簡便、結(jié)果便于觀察，但在最終設(shè)計蘆丁的藥效學(xué)實驗時，并未借鑒這篇文獻(xiàn)的思路。

3.2 實驗實施

3.2.1 槐米的質(zhì)量評價 藥典及相關(guān)文獻(xiàn)顯示，生槐米中蘆丁含量較高，且原藥材來源簡單，可以作為蘆丁的提取原料［1，9］。本實驗中需注意的是，供試品制備時加入甲醇的量要嚴(yán)格控制，在超聲提取前后要精密稱量，準(zhǔn)確補(bǔ)足因超聲引起的甲醇重量的減少。最初的實驗由于未能重視這一環(huán)節(jié)，加入過多的甲醇，導(dǎo)致蘆丁濃度降低，結(jié)果不準(zhǔn)確。

3.2.2 槐米中蘆丁的提取精制與含量測定 采用水提醇沉法提取精制槐米中的蘆丁，然后檢測精制品中蘆丁的含量，計算其提取率。從原藥材中提取蘆丁1.91 g，精制品蘆丁含量為89.02%，提取率僅為53.35%。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，提取率低的原因主要是趁熱過濾這一步驟出現(xiàn)問題，由于當(dāng)時室溫較低，加之操作不熟練，導(dǎo)致部分產(chǎn)物析出，從而得到的蘆丁精制品的量較少。此外，蘆丁作為植物來源的藥物，在提取過程中會帶入其他成分的雜質(zhì)，部分雜質(zhì)具有與蘆丁近似的溶解性［10］，并且加熱提取常生成一些水解產(chǎn)物［11］。實驗過程中由于實驗設(shè)備、實驗時間等的限制，未能采取有效的提取步驟和高效的純化步驟，故蘆丁提取率較低，并且精制品內(nèi)蘆丁含量不高。

3.2.3 蘆丁的藥效學(xué) 通過調(diào)研文獻(xiàn)，我們了解到蘆丁具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化作用、血管舒張作用、抗病毒作用、拮抗血小板活化因子作用等多種生物學(xué)活性［5］?？紤]到實驗室設(shè)備、實驗時間及實驗操作的簡便性等因素，在保證文獻(xiàn)真實可靠的情況下，我們選擇檢測蘆丁的血管舒張作用作為其藥效學(xué)實驗的考察對象。為避免蘆丁含量不準(zhǔn)確所產(chǎn)生的影響，藥效學(xué)實驗中我們選用蘆丁對照品。實驗中應(yīng)注意，將大鼠主動脈剪成2～3 mm寬的血管環(huán)時，避免過度牽拉，以防損傷內(nèi)皮。原因是蘆丁在一定濃度范圍內(nèi)對內(nèi)皮完整的離體大鼠胸主動脈環(huán)具有舒張作用，而對NE預(yù)收縮后內(nèi)皮去除動脈環(huán)的血管張力無明顯影響［4］。此外，實驗中1 000 m l K-H液含NaCl 6.92 g、KCl 0.35 g、CaC12 0.28 g、KH2 PO4 0.16 g、MgSO4 0.29 g、NaHCO32.1 g和葡萄糖2.0 g，配制時應(yīng)注意CaC12、NaHCO3、MgSO4需分別溶解后再與其他溶液混合，否則易產(chǎn)生沉淀，影響藥效學(xué)結(jié)果。本實驗因條件所限存在的不足：實驗應(yīng)多設(shè)幾組，每組加入不同量的蘆丁，使灌流液中蘆丁濃度形成梯度，以檢測蘆丁是否在一定濃度范圍內(nèi)對內(nèi)皮完整的主動脈環(huán)具有濃度依賴性的舒張作用。此外，還應(yīng)增設(shè)內(nèi)皮損傷組，以驗證蘆丁對NE預(yù)收縮后內(nèi)皮去除動脈環(huán)的血管張力無明顯影響。

3.2.4 蘆丁片劑的制備與評價 由于實驗自制的蘆丁含量不高，產(chǎn)率有限，故制備蘆丁片劑時采用大連美侖生物技術(shù)有限公司提供的蘆丁。為改善蘆丁在水中溶解度低和在生物體內(nèi)穩(wěn)定性差的問題，提高其藥理活性，研究人員對蘆丁的劑型做了改進(jìn)［12］。普通蘆丁片劑的蘆丁含量較低，需服3～4次／d，每次1～2片，血藥濃度不穩(wěn)定，增加了藥物不良反應(yīng)，患者用藥依從性較低。故本實驗將其制成緩釋片。對制得的片劑需進(jìn)行質(zhì)量檢查，包括外觀形狀、片重差異、崩解時限、溶出度或釋放度、含量均勻度等。藥典規(guī)定每片主藥標(biāo)示量不大于25 mg或每片含量不大于25%時，均應(yīng)檢查其含量均勻度［13］。本實驗制備的蘆丁片劑的標(biāo)示量為40 mg／片，每片蘆丁含量為37.74%（＞25%），所以本實驗不涉及含量均勻度的檢查。對于緩釋制劑一般都需檢查釋放度。對已檢查釋放度的制劑不再進(jìn)行崩解時限的檢查［13］。由于實驗時間的限制，檢測片劑中蘆丁含量及不同時間的釋放度時，未采用之前含量測定所用的高效液相色譜法，使用的是操作較為簡便但同樣靈敏的紫外分光光度法［6］。

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Research on the technological process andmethods of the comprehensive pharmaceutical experiment of rutin tablets

CHEN Li，DU Hongli，ZENG Rentao，ZHANG Yeye，LU Ying，CAIGuojun（Schoolof Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo imitate the development process of new drugsw ith rutin as themodel and to domultidisciplinary experiments of preparation and pharmacodynam ics of rutin tablets.MethodsThin-layer chromatography was used to identify rutin in Pagodatree flower bud.High-performance liquid chromatography was used for quantitative determination of rutin in Pagodatree flower bud and rutin products.The vasodilatation effect of rutin was investigated.The preparation of rutin tablets was completed.Results and ConclusionWe completed the identification of Pagodatree flower bud，extraction and purification of rutin from Pagodatree flower bud，the assay of rutin，the pharmaco-dynam ics study and the formulation of rutin tablets.The experiments helped the postgraduates to be familiar w ith the research process of new drugs and to improve their experimental operation skills.

multidisciplinary experiments；rutin；pharmacodynam ics；tablets

R961；R943

A

1006-0111（2015）04-0359-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.018

2014-06-25

2015-01-12［本文編輯］李睿旻

陳 莉，碩士研究生.Tel：18321780962；E-mail：cl287506435＠163.com

蔡國君，副教授.研究方向：心血管藥理學(xué).Tel：（021）81871282；E-mail：cai_gj＠yahoo.com