高效液相色譜法測定血清碘海醇濃度方法的建立和應(yīng)用

王寶寶，武元，付 強(qiáng)，弓孟春，石希敏，景紅麗，李 方，陳朝英，宋紅梅，秦 巖*，李雪梅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1.腎內(nèi)科;2.藥劑科;3.核醫(yī)學(xué)科;5.兒科，北京100730;4.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京100020)

腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)是評價(jià)腎臟功能的最佳指標(biāo)。以內(nèi)源性標(biāo)志物為基礎(chǔ)的eGFR(estimated glomerular filtration rate，eGFR)預(yù)測公式為臨床廣泛應(yīng)用。然而，國內(nèi)兒童eGFR公式多是采用國外公式[1-2]，其在中國兒童中的適用性并未得到廣泛認(rèn)可。碘海醇血漿清除率因操作方法簡便、無放射性，與菊粉及放射性標(biāo)志物(如99mTc-DTPA和51Cr-EDTA 等)清除率具有較好的一致性，在國外被用來評估包括兒童在內(nèi)的廣泛人群的GFR[3-5]。而且，其用于評估腎功能時(shí)所用劑量約為5 mL，為常規(guī)造影劑量的1/20，安全性非常好[2，6]。但是，國內(nèi)關(guān)于碘海醇濃度測定方法的研究較少，使得碘海醇清除率尚未推廣。本研究擬建立測定血清碘海醇濃度的HPLC 法，并探索碘海醇清除率在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)兒童腎功能評價(jià)方面的可行性。

1 材料與方法

1.1 患者一般資料

33例CKD 患兒中，男13例，女20例，平均年齡(11.8±2.5)歲，身高(148.4±15.7)cm，體質(zhì)量(45.5±18.0)kg，血清肌酐為(59.42±21.31)μmol/L(酶法)。33例患兒以99mTc-DTPA血漿清除率為CKD分期標(biāo)準(zhǔn)分為:1期13例，2期15例，3期5例。

該研究通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的審查。所有患兒接受檢查前均由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 HPLC方法建立

1.2.1 試劑:碘海醇標(biāo)準(zhǔn)品(98%，Sigma 公司)。內(nèi)標(biāo)(internal standard，IS):碘海醇雜質(zhì)B(100%，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2.2 色譜條件:色譜柱(日本島津CLC-ODS，150 mm×6.0 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈與超純水3∶97體積配制(磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0～3.5)，檢測波長(λ)254 nm，柱溫40℃，流動(dòng)相流速1.2 mL/min。

1.2.3 溶液配制:1)碘海醇標(biāo)準(zhǔn)母液(10 g/L)。2)內(nèi)標(biāo)為碘海醇雜質(zhì)B 溶液(1 g/L)。3)血清標(biāo)準(zhǔn)曲線(10～1 000 mg/L，n=7):將碘海醇標(biāo)準(zhǔn)母液分別以空白血清稀釋，配制血清標(biāo)準(zhǔn)曲線系列，濃度分別為1 000、500、250、100、50、25 和10 mg/L。4)血清質(zhì)控樣本(低、中和高濃度):將碘海醇標(biāo)準(zhǔn)母液以空白血清稀釋成20、200 和750 mg/L 質(zhì)控樣本。用于方法學(xué)批間(n =6)、批內(nèi)(n =10)及回收率變異性考察。

1.2.4 樣本體系配制:取100 μL 樣本(標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本或質(zhì)控樣本)加入20 μL 內(nèi)標(biāo)液，再加入100 μL高氯酸(5%)，沉淀離心后取10 μL 上清液進(jìn)樣分析。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證:包括線性關(guān)系考察、精密度、真實(shí)性考察及藥物干擾性試驗(yàn)。

1.3 HPLC 法用于碘海醇血漿清除率的測定

1.3.1 受試對象:納入2013年4月至2014年2月在北京協(xié)和醫(yī)院和首都兒童研究所就診的CKD 兒童33例。排除如下情況:急性腎損傷，嚴(yán)重浮腫，明確的全身性感染，惡性腫瘤病史，近期重大手術(shù)病史及無法配合檢查者。所有患兒采用最新Schwartz 公式估算eGFR[2]，并同時(shí)進(jìn)行99mTc-DTPA血漿清除率及碘海醇血漿清除率測定。

1.3.2 碘海醇和99mTc-DTPA血漿清除率測定:檢查日，鼓勵(lì)患兒多飲水、多排尿。在一側(cè)上肢靜脈注射5 mL 碘海醇(歐乃派克300，通用公司)后，于2和5 h在對側(cè)靜脈取血，于血清管中離心，采用HPLC方法測定碘海醇濃度。碘海醇清除率計(jì)算公式[7]為GFR(mL/min)=Q0/(c1/b)。其中，碘海醇血清濃度分別記為C(2 h)和C(5 h)。以[ln C(2 h)，120 min]和[ln C(5 h)，300min]兩點(diǎn)描記一條直線。c1代表此直線截距所對應(yīng)的碘海醇濃度值，而b代表其斜率。Q0為注射碘海醇總量。

在另一側(cè)上肢“彈丸式”注射99mTc-DTPA后，于2和4 h 對側(cè)取血，肝素抗凝，離心后取血漿1 mL，用于測定血漿中99mTc-DTPA 放射性粒子數(shù)。雙血漿法99mTc-DTPA清除率計(jì)算公式[8]為GFR (mL/min)={[Dln (C1/C2)]/(T2-T1)}exp {[(T1lnC2)-(T2lnC1)]/(T2-T1)}。其中:D 為注入藥物的放射性計(jì)數(shù);T1、T2分別為注入放射性藥物至第1次和第2次采血時(shí)間(min)，C1、C2分別為T1和T2時(shí)血漿中放射性計(jì)數(shù)。

兩種方法的血漿清除率均采用兒童Brochner-Mortensen 公式[9]進(jìn)行單室模型校正和Haycock's 公式進(jìn)行體表面積(BSA)校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 和MedCalc 11.1.1.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Pearson 相關(guān)性系數(shù)判斷兩種方法之間的相關(guān)性;使用偏倚、Bland-Altman 分析判斷兩種方法的一致性;使用研究方法測定GFR位于參照方法GFR±15%和±30%區(qū)間的比例判斷GFR 預(yù)測的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)比較采用配對t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HPLC方法建立與驗(yàn)證

2.1.1 色譜行為:在設(shè)定的色譜條件下，空白血清色譜圖可見血清雜峰多集中在5 min 之前，之后基線平坦(圖1)。血清中加入碘海醇和內(nèi)標(biāo)后，可見碘海醇及內(nèi)標(biāo)峰位處背景干凈，無雜峰干擾，二者可達(dá)基線分離。碘海醇以兩種異構(gòu)體的形式同時(shí)存在，其洗脫時(shí)間分別為10.17 和11.38 min。內(nèi)標(biāo)洗脫時(shí)間為8.91 min。(圖2)。

圖1 空白血清的色譜圖Fig1 HPLC chromatogram of blank serum

圖2 血清中加入內(nèi)標(biāo)和碘海醇的色譜圖Fig2 HPLC chromatogram of internal standard (IS)and iohexol (The concentration of IS and iohexol was 1 g/L and 200 mg/L respectively)

2.1.2 方法學(xué)驗(yàn)證:通過計(jì)算碘海醇和內(nèi)標(biāo)的峰高比(peak height ratio，PHR)，由峰高比對標(biāo)示濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 3.1368X+0.0034(R2=0.9998)，說明碘海醇血清濃度在10～1 000 mg/L 范圍內(nèi)線性良好(圖3)。批間測量(n=6)和批內(nèi)測量(n=10)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)均控制在5%以下，回收率(R%)達(dá)96%以上(表1)。將3個(gè)質(zhì)控樣本在室溫自然光下放置12 h，其濃度RSD%均＜2%。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)在-60℃和室溫下反復(fù)凍融6次后，其濃度RSD%同樣＜2%。此外，對正在使用包括降壓藥、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、抗生素類等30 余種臨床常用藥物的患者血清進(jìn)行HPLC 分析，在碘海醇和內(nèi)標(biāo)峰位處均未發(fā)現(xiàn)干擾峰的存在。

圖3 碘海醇和內(nèi)標(biāo)的峰高比(PHR)對碘海醇濃度(C)進(jìn)行線性回歸Fig3 The linear regression between peak height ratio of iohexol to internal standard (IS)and the concentration of iohexol

表1 HPLC 法測定血清碘海醇的方法學(xué)驗(yàn)證Table1 The validation of HPLC method for measurement of serum iohexol concentration

2.2 碘海醇血漿清除、eGFR 與99mTc-DTPA血漿清除率比較

碘海醇血漿清除率、eGFR 分別與99mTc-DTPA血漿清除率進(jìn)行相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.95(P＜0.05)(圖4)與0.63(P＜0.05)(圖5)。Bland-Altman 一致性分析顯示碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率的差值為(6.24±10.81)mL/(min·1.73 m2)，最大差值的絕對值為32.62 mL/(min·1.73 m2)(圖6A);eGFR 與99mTc-DTPA血漿清除率的差值為(12.11±22.96)mL/(min·1.73 m2)(圖6B)，最大差值的絕對值為74.76 mL/(min·1.73 m2)。碘海醇血漿清除率、eGFR位于99mTc-DTPA血漿清除率±15%范圍內(nèi)比例分別為75.76%和45.45%;±30%范圍內(nèi)比例分別為97.06%和75.76%。因此，碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率具有更好的相關(guān)性和一致性。

圖4 碘海醇清除率與99mTc-DTPA 清除率的相關(guān)性分析Fig4 The correlation between iohexol plasma clearance and 99mTc-DTPA clearance

圖5 eGFR 與99mTc-DTPA 清除率的相關(guān)性分析Fig5 The correlation between eGFR by formula and99mTc-DTPA clearance

圖6 碘海醇清除率、eGFR 與99mTc-DTPA 清除率的bland-altman 分析Fig6 The bland-altman analysis of two methods

3 討論

碘海醇血漿清除率用于評價(jià)GFR 具有準(zhǔn)確性好、操作方法簡便、安全、無放射性等優(yōu)點(diǎn)。而血清碘海醇濃度的準(zhǔn)確測定是該方法應(yīng)用的前提。以往，碘海醇濃度測定多采用X-ray 熒光法[5，10]，但這種方法在碘海醇濃度較低時(shí)準(zhǔn)確性變差，碘海醇用量需10～50 mL，這可能會損害部分患者腎功能。而HPLC 法靈敏度較高，碘海醇用量僅約5 mL，在用這種低劑量碘海醇評估腎功能的研究中均未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)事件[6，11]。本研究建立了血清碘海醇濃度測定的HPLC 法，碘海醇血清標(biāo)準(zhǔn)曲線位于較廣區(qū)間內(nèi)，且線性良好。對碘海醇樣本進(jìn)行放置和凍融穩(wěn)定性的研究結(jié)果顯示，碘海醇樣本本身性質(zhì)穩(wěn)定，不易被降解，這與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致。另外，藥物干擾性試驗(yàn)表明臨床常用藥物不會對HPLC 法測定碘海醇濃度造成干擾。

使用血清生化指標(biāo)估算GFR (eGFR)一直以來都是腎內(nèi)科學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[13-14]。以血清肌酐為基礎(chǔ)的兒童Schwartz 公式仍是臨床最常用的預(yù)測公式。但是，國內(nèi)尚無使用外源性標(biāo)志物血漿清除率法進(jìn)行兒童GFR的研究，因而，基于西方兒童而研發(fā)的eGFR 公式在中國兒童中的適用性并不明確。本研究結(jié)果表明通過最新Schwartz 公式計(jì)算得eGFR 與雙血漿99mTc-DTPA 清除率的差異明顯高于碘海醇血漿清除率與該標(biāo)準(zhǔn)的差異。

綜上所述，本研究建立了利用HPLC 法測定血清碘海醇濃度的方法，該法穩(wěn)定、可靠，為使用碘海醇測定GFR的推廣解決了技術(shù)性問題;并初步探索了碘海醇清除率用于CKD 兒童腎功能評價(jià)的可行性。今后將擴(kuò)大CKD 各個(gè)分期的患兒樣本例數(shù)，進(jìn)一步完善碘海醇血漿清除率在中國CKD 兒童腎功能評價(jià)方面的應(yīng)用，并對國際上的eGFR 預(yù)測公式進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立適合中國兒童的eGFR 公式。

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