小鼠肝移植模型中調節(jié)性T細胞的數(shù)量和表型改變

陳國鋒，蔡國軍，李國鋒，王介川，鄭樹森

(浙江大學 醫(yī)學院1.附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科;2.附屬第二醫(yī)院 濱江院區(qū) 普外科，浙江 杭州310003;3.杭州市蕭山區(qū)第四人民醫(yī)院 普外科，浙江 杭州311225)

中國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，目前全國已有超過3，000萬的乙型肝炎患者。相當一部分乙肝患者發(fā)展為肝硬化及肝癌[1]。肝移植一直是終末期肝病患者的唯一治療途徑[2]。由于同種異體免疫排斥反應的存在，研究如何誘導和維持免疫耐受一直是器官移植領域的熱點和難點[3-4]。

越來越多的實驗證實，具有免疫調節(jié)作用的CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)能夠下調宿主內對移植物的排斥反應，延長器官移植物的存活時間，在免疫耐受形成的過程中也發(fā)揮重要作用[5]。免疫耐受與肝移植術后宿主內調節(jié)性T細胞的數(shù)量及表型的變化密切相關。但很多文獻也沒有闡述該變化的相關性。本實驗旨在探究小鼠肝移植術后，移植物的排斥反應和移植物內調節(jié)性T細胞的數(shù)量和表型隨時間變化的規(guī)律，為揭示免疫耐受的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:清潔級雄性C57Bl/6 小鼠16只，Balb/c小鼠48只，8～12周齡，體質量24～29 g?！舱憬嶒瀯游镏行模S可證:SCXK(浙)2014-0001〕。

1.1.2 主要試劑:肝臟保存液(UW 液)，反轉錄酶(Sigema 公司)，SYBN 實時熒光定量試劑盒(Takara公司)，抗CD3、B220 和Foxp3 單克隆抗體(Abcam 公司)，抗CLAT-4 FITC 熒光抗體(eBioscience 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝移植模型建立:供肝植入時，用“套袖法”完成門靜脈、肝下下腔靜脈重建，用支架法重建膽管。

1.2.2 動物分組:實驗組行異基因肝移植，C57Bl/6-Balb/c 肝移植;對照組行同基因肝移植，Balb/c-Balb/c肝移植。術后3、7、14 和28 d 分別取肝臟固定或液氮保存，部分用于提取分離調節(jié)性T細胞表型鑒定。

1.2.3 HE染色及排斥活性指數(shù)評定:將肝臟標本進行HE染色。按照Banff 評分標準(表1)對不同時間點肝臟組織切片進行排斥活性指數(shù)的評定。RAI 0～2 分定為無排斥;3 分為不確定性改變;4～5分為輕度排斥(Ⅰ級);6～7 分為中度排斥(Ⅱ級);8～9 分為重度排斥(Ⅲ級)。

1.2.4 免疫組化染色:用抗CD3、B220 及Foxp3 單克隆抗體對肝臟切片標本行免疫組化染色，并高倍鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)量。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測Foxp3表達:Trizol提取肝臟組織總RNA，測定含量并計濃度，采用Oligo(dT)反轉錄法，將RNA 反轉錄為cDNA。用熒光定量PCR 試劑進行擴增40個循環(huán)，采用2－△△Ct法進行結果統(tǒng)計分析。

1.2.6 流式細胞術檢測調節(jié)性T細胞表型改變:利用膠原蛋白酶IV 對小鼠肝臟進行消化，采用全自動免疫磁珠分選系統(tǒng)對肝臟內的Treg 進行分離提取，利用抗CLAT-4-FITC 抗體對Treg 進行染色后，經(jīng)BD Laser Ⅱ型流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗所得數(shù)據(jù)應用SPSS 統(tǒng)計軟件(V 16.0)進行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗。

2 結果

2.1 術后移植肝的排斥反應

同基因組小鼠移植肝臟病理切片可見肝內炎性反應較輕，術后第3 天達到高峰，至第7天左右基本恢復正常。異基因組的小鼠則發(fā)生了明顯的急性排斥反應:術后第7天排斥反應達到高峰，后逐漸消退，至28天，基本恢復至正常(圖1)。對兩組移植肝的標本進行病理學評分，結果在移植后早期(移植后3 d)，兩組移植肝內均有一定量的炎性細胞浸潤且數(shù)量相當，隨后，異基因移植肝總的浸潤細胞顯著增多，并在移植后7 d 達到高峰(表2)。

表1 肝移植后急性排斥反應的排斥活性指數(shù)(RAI)Table1 Rejection activity index(RAI)of acute rejection after liver transplantation

圖1 移植肝內組織切片F(xiàn)ig1 Post-operative rejection in liver graft(×200)

表2 同、異基因組肝移植術后病理學排斥評分Table2 RAI in isogenic and allogeneic graft after liver transplantation(RAI)

2.2 移植物內浸潤淋巴細胞的類型

T 淋巴細胞是異基因移植肝內浸潤的主要淋巴細胞類型(圖2)。

2.2 移植肝內Foxp3 陽性T細胞的改變

移植術后不同時間點的異基因移植肝內Foxp3 陽性調節(jié)性T細胞主要分布于移植肝臟的匯管區(qū)(圖3A，B);術后第3 天Foxp3 陽性細胞開始增多，第7～14 天逐漸達到高峰期，第14 天后逐漸下降并趨于穩(wěn)定維持在相對較高的水平。同基因組移植肝內則未見明顯Foxp3 陽性調節(jié)性T細胞的改變(圖3C)。

圖2 移植肝內浸潤細胞免疫組化染色Fig2 Infiltrating lymphocytes in liver graft(×400)

圖3 移植肝內調節(jié)性T細胞表達增加Fig3 Alteration of Foxp3-positive T cells count and Foxp3-mRNA level in liver graft (×400)

異基因組移植肝內Foxp3 mRNA表達水平在術后逐漸升高，第14 天達到高峰，隨后下降并穩(wěn)定維持存在。同基因組移植物內Foxp3 mRNA表達則無明顯改變(圖3D)。

2.4 調節(jié)性T細胞表面CTLA-4的改變

移植術后14 d，異基因移植組的移植肝、脾和移植物引流淋巴結中的Tregs 比例均較同基因移植組明顯升高(圖4)。

圖4 同、異基因移植組術后14 天的移植肝、脾臟和引流淋巴結中Tregs的比例Fig4 Ratios of Tregs cells in graft liver，spleen，drainage lymph nodes in Allogeneic graft and isogeneic graft

異基因移植肝內浸潤的調節(jié)性T細胞表面CTLA-4表達顯著高于同基因組，且在移植后移植保持較高表達水平(P＜0.05)(圖5)。

圖5 調節(jié)性T細胞表面CTLA-4表達增加Fig5 CTLA-4 Expression alteration on regulating T cells

3 討論

調節(jié)性T細胞在移植免疫排斥反應中發(fā)揮著作用，同時也參與到移植物免疫耐受的形成[6]。臨床及基礎研究均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg 細胞能夠誘導移植免疫耐受的形成[7-8]。Foxp3 也被認為是調節(jié)性T細胞(Treg)的重要標志性分子[9]。

本研究在同基因和異基因肝移植模型術后，兩組的炎性反應的時間及程度的不同;術后浸潤的炎性細胞主要為T 淋巴細胞，其中Foxp3 陽性的調節(jié)性T細胞數(shù)量及Foxp3 mRNA的變化也與移植物中浸潤淋巴細胞的變化一致;流式細胞術分析可見調節(jié)性T細胞表面的CTLA-4 也隨著Foxp3的改變而出現(xiàn)相應變化。

上述免疫排斥反應隨時間的變化規(guī)律與Foxp3 mRNA的變化規(guī)律及Foxp3 陽性細胞數(shù)量的變化規(guī)律互相吻合，這也說明了異基因肝移植術后發(fā)生了針對同種異體抗原的急性免疫排斥反應，并在第7天后逐漸達到高峰，與此同時Foxp3 mRNA的表達逐漸上調，F(xiàn)oxp3表達量上升，促使調節(jié)性T細胞發(fā)育和活化;在術后第14 天左右，調節(jié)性T細胞的數(shù)量逐漸達到高峰，隨著其負向調節(jié)功能的增強，免疫排斥反應開始逐漸減弱，浸潤的淋巴細胞開始逐漸下降;至術后28 天左右，移植物內浸潤的淋巴細胞明顯減少，排斥活性指數(shù)下降至正常提示移植肝達到免疫耐受，此后可見少量調節(jié)性T細胞持續(xù)存在于移植肝匯管區(qū)，以維持免疫耐受的穩(wěn)態(tài)。

CTLA-4 與B7 分子結合后可誘導T細胞無反應，參與免疫反應的負調節(jié)[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)移植術后隨著Foxp3表達的增高，調節(jié)性T細胞表面的CTLA-4的表達也達到高峰提示調節(jié)性T細胞功能的活化;此后，調節(jié)性T細胞表面的CTLA-4則穩(wěn)定存在，也提示在耐受期，調節(jié)性T細胞仍然發(fā)揮作用，維持免疫耐受狀態(tài)的穩(wěn)定。

本實驗證實異基因肝移植術后，肝臟內的調節(jié)性T細胞參與了機體對移植物排斥反應的調節(jié)，并最終導致移植肝免疫耐受，為下一步揭示移植物內調節(jié)性T細胞通過何種機制誘導移植物耐受提供了很好的研究基礎;同時也為將調節(jié)性T細胞作為一種有效的免疫調節(jié)工具應用于器官移植領域提供了理論依據(jù)。

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