上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1(ESRP1)在人卵巢癌組織及細胞系的表達

袁成福，李志紅，彭 帆，肖方祥

(三峽大學 醫(yī)學院 生物化學教研室，湖北 宜昌443002)

卵巢癌是危害廣大婦女健康最常見的惡性腫瘤之一。人上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1 (epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1)通過與富含UGG的序列結合，可促進上皮基因亞型的選擇性剪接，如成纖維細胞生長因子受體2 (fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2)[1]。近期研究表明:人乳頭瘤病毒HPV16 癌蛋白E5 可通過ESRP1 誘導FGFR2b 向FGFR2c 亞型的轉(zhuǎn)換，從而使宮頸癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移，這表明ESRP1 可能和宮頸癌轉(zhuǎn)移事件有關[2]。ESRP1 在卵巢癌中是否具有作用以及具有怎樣的作用，目前沒有文獻報道。本研究擬檢測卵巢癌組織及細胞系中ESRP1表達水平，及其與FGFR2 亞型轉(zhuǎn)換的關系，為研究ESRP1 在卵巢癌中的作用及分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源:24例新鮮切除的卵巢癌手術標本均來自三峽大學附屬第一醫(yī)院病理科。該標本的獲取已得到患者簽署的知情同意書，并獲得三峽大學倫理委員會的審查批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):正常卵巢上皮細胞OSE、永生化的卵巢上皮細胞IOSE120T、IOSE398、卵巢癌細胞A2780、OVCAR3、OVCAR5、SKOV3、OVCAR8 及卵巢畸胎瘤PA-1 細胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 PCR檢測相關基因表達:常規(guī)提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴增目的基因。

1.2.3 Western blot檢測ESRP1蛋白的表達:從部分新鮮標本提取蛋白后，進行常規(guī)Western blot 實驗。

1.3 統(tǒng)計學分析:使用SPSS 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，均數(shù)比較用方差分析，若方差不齊，采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 PCR檢測不同卵巢癌細胞系中ESRP1 mRNA的表達:在正常卵巢上皮細胞OSE、永生化的卵巢上皮細胞IOSE120T、IOSE398 及卵巢癌A2780 細胞中，ESRP1 mRNA表達水平較低;在卵巢癌細胞OVCAR3、OVCAR5 中ESRP1 mRNA表達水平較高;在卵巢癌SKOV3、OVCAR8 及卵巢畸胎瘤PA-1 細胞中ESRP1 mRNA的表達介于中間水平(圖1)。

圖1 不同卵巢癌細胞系中ESRP1 mRNA表達的PCR 結果Fig1 ESRP1 mRNA expression levels in different ovarian cancer cell lines were determined by PCR

2.2 Real time PCR檢測不同卵巢癌臨床樣本中ESRP1 mRNA的表達:在24例卵巢癌組織中有19例ESRP1 mRNA的表達顯著高于對應的正常卵巢組織(圖2)。

圖2 Real time PCR檢測不同卵巢癌臨床樣本中ESRP1 mRNA的表達水平Fig2 ESRP1 mRNA expression levels were determined in different ovarian cancer tissues by real time PCR(±s，n=3)

圖3 Western blot檢測部分卵巢癌臨床樣本中ESRP1蛋白的表達Fig3 ESRP1 protein expression levels were determined in different ovarian cancer tissues by Western blot

2.3 Western blot檢測部分卵巢癌臨床樣本中ESRP1蛋白的表達:在所選的6例卵巢癌組織中ESRP1蛋白的表達均顯著高于對應的癌旁正常卵巢組織(圖3)。

2.4 Real time PCR檢測不同卵巢癌細胞系中FGFR2b及FGFR2c 亞型的表達:在正常卵巢上皮細胞OSE、永生化的卵巢上皮細胞IOSE120T、IOSE398 及卵巢癌A2780、SKOV3、OVCAR8 及卵巢畸胎瘤PA-1 細胞中，主要表達FGFR2c 亞型;在卵巢癌細胞OVCAR3、OVCAR5 中主要表達FGFR2c 亞型(圖4)。

圖4 Real time PCR檢測不同卵巢癌細胞系中FGFR2b 及FGFR2c 亞型的表達Fig4 FGFR2b and FGFR2c mRNA expression levels were determined in different ovarian cancer cell lines by real time PCR(±s，n=3)

3 討論

ESRP1能調(diào)控其靶基因FGFR2的選擇性剪接[3]。FGFR2有兩種亞型，即FGFR2b 與FGFR2c，F(xiàn)GFR2b代表上皮型細胞表型，而FGFR2c代表間質(zhì)型細胞表型。ESRP1 可調(diào)控FGFR2b 向FGFR2c的亞型轉(zhuǎn)換[2]，因此，推測ESRP1可調(diào)控細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT);而EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的早期事件，這表明ESRP1 可能與腫瘤的侵潤轉(zhuǎn)移事件相關。卵巢癌具有較高的轉(zhuǎn)移性，那么ESRP1 在卵巢癌事件中是否發(fā)揮重要作用?目前沒有相關文獻報道。

本研究中，用real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)在24例卵巢癌標本中，有19例ESRP1 mRNA的表達顯著高于對應正常的癌旁組織;部分標本的Western blot 結果也顯示ESRP1 在卵巢癌中的表達高于對應正常的癌旁組織，這表明ESRP1 可能在卵巢癌事件中發(fā)揮重要作用。本研究中PCR檢測發(fā)現(xiàn)在OSE、IOSE120T、IOSE398 A2780 細胞中，ESRP1 mRNA表達水平較低;OVCAR3、OVCAR5細胞中ESRP1 mRNA表達水平較高;在SKOV3、OVCAR8 及PA-1 細胞中ESRP1 mRNA的表達介于中間水平，這和臨床標本的檢測結果具有一致性。同時也發(fā)現(xiàn)在ESRP1表達較低或處于中間水平的OSE、IOSE120T、IOSE398、A2780、SKOV3、OVCAR8、PA-1 細胞中，主要表達FGFR2c 亞型，而在ESRP1表達較高的OVCAR3、OVCAR5 中主要表達FGFR2b 亞型，這表明在卵巢癌中，ESRP1 與FGFR2 亞型轉(zhuǎn)換有關;并且這種亞型轉(zhuǎn)換很可能是以“全或無”方式進行。FGFR2 亞型轉(zhuǎn)換是腫瘤惡性表型的基礎[4]，因此，ESRP1 在卵巢癌事件中的作用很可能是通過FGFR2 亞型轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)的。

[1]Warzecha CC，Sato TK，Nabet B，et al.ESRP1 and ESRP2 are epithelial cell-type-specific regulators of FGFR2 splicing[J].Mol Cell，2009，13:591-601.

[2]Ranieri D，Belleudi F，Magenta A，et al.HPV16 E5 expression induces switching from FGFR2b to FGFR2c and epithelial-mesenchymal transition[J].Int J Cancer，2015，137:61-72.

[3]Warzecha CC，Jiang P，Amirikian K，et al.An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelialmesenchymal transition [J].EMBO J， 2010， 29:3286-3300.

[4]Zhao Q，Caballero OL，Davis ID，et al.Tumor-specific isoform switch of the fibroblast growth factor receptor 2 underlies the mesenchymal and malignant phenotypes of clear cell renal cell carcinomas[J].Clin Cancer Res，2013，19:2460-2472.