異氟烷減輕人心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的研究

梁 冰，方 潔

(河南中醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 麻醉科，河南 鄭州450000)

非致命性心梗導(dǎo)致的心臟功能受損是臨床治療中一個(gè)最大的難題，其病理學(xué)機(jī)制主要是缺血/再灌注(IR)造成的心肌損傷。IR 可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡而致細(xì)胞死亡[1]。缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是臨界氧敏感性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵因子，被認(rèn)為是IR 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可有效保護(hù)IR 對(duì)心肌細(xì)胞的損傷[2]。異氟烷是臨床中最常應(yīng)用的全身麻醉藥。體內(nèi)外研究均報(bào)道異氟烷預(yù)處理對(duì)心肌IR 損傷具有保護(hù)作用[3]。異氟烷可通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)缺血性腦損傷[4]和血管IR 損傷[5]的保護(hù)作用，但異氟烷是否通過HIF-1α 通路發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，目前鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以缺氧/復(fù)氧(AR)人心肌細(xì)胞作為IR 損傷心肌的體外模型，研究異氟烷對(duì)心肌細(xì)胞AR 損傷和HIF-1α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人心肌細(xì)胞系HCM(ATCC);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司);胎牛血清FBS(Hyclone 公司);CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);LDH活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);RNA 提取試劑盒與lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara 公司);HIF-1α siRNA和非特異性siRNA(Qiagen 公司);兔抗HIF-1α 和兔抗β-actin 抗體(Santa Cruz 公司);辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔二抗(Cell Signaling 公司)。

1.2 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型的建立

參照Liu 等[6]的方法制備缺氧培養(yǎng)液。缺氧處理前先將細(xì)胞培養(yǎng)液換為缺氧培養(yǎng)液，并將細(xì)胞置于含5% CO2和95% N2的無氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液換為復(fù)氧培養(yǎng)液，并將細(xì)胞置于37℃、5% O2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將細(xì)胞分為對(duì)照組(con)和AR 組及異氟烷處理組。AR 組細(xì)胞經(jīng)3 h 缺氧和3 h 復(fù)氧處理;異氟烷處理組細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度異氟烷(0.5%、1%、1.5%和2%)預(yù)處理20 min后，進(jìn)行3 h 缺氧和3 h復(fù)氧處理。收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染

將心肌細(xì)胞HCM 培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA(siRNA)或非特異性siRNA(scramble)。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用2%異氟烷預(yù)處理3 h后，進(jìn)行3 h 缺氧和3 h 復(fù)氧處理，收集細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。HIF-1α siRNA 正義鏈:5'-GAAGAACUAUGAACAUAAATT-3';反義鏈:5'-UUUAUGUUCAUAGUUCUUCCT-3'。

1.5 細(xì)胞存活率檢測(cè)

用CCK-8 試劑盒檢測(cè)HCM 細(xì)胞活力。將HCM 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 接種于96孔板中，同1.3 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每孔加入20 μL CCK-8 溶液，孵育1 h后測(cè)定450 nm 處吸光度A值。

1.6 LDH活性檢測(cè)

用LDH活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡。同1.3 培養(yǎng)并收集細(xì)胞，用冷PBS 清洗細(xì)胞后，加入500 μL緩沖液調(diào)整細(xì)胞至1×106個(gè)/mL，加入5 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min后，立即加入5 μL PI室溫避光繼續(xù)孵育5 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 RT-PCR檢測(cè)HIF-1α mRNA表達(dá)水平

總RNA 提取試劑盒提取HCM 細(xì)胞RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(n =5)。HIF-1α 上游引物序列:5'-CCAGCAGACTCAAATACA AGAACC-3';下游引物序列:5'-TGTATGTGGGTAGGA GATGGAGAT-3'。RT-PCR 反應(yīng)體系20 μL(2 μL cDNA;上下游引物各0.5 μL;ddH2O217 μL)。以GAPDH為內(nèi)參(上游引物序列:5'-GCACCGTCAAGGCTGAG AAC-3';下游引物序列:5'-ATGGTGGTGAAGACGCC AGT-3')。PCR 產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.9 Western blot檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后HIF-1α蛋白表達(dá)水平

提取細(xì)胞總蛋白并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣20 μg 進(jìn)行凝膠電泳(8%分離膠和5%濃縮膠)并轉(zhuǎn)膜，加入兔抗HIF-1α(1∶1 000)4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)孵育1 h。DAB 顯色，暗室曝光，分析吸光度值(n =5)。以β-actin 為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 異氟烷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活力和LDH活性的影響

AR 組心肌細(xì)胞活力顯著低于con組(P＜0.05)。異氟烷可劑量依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞活力增加(P＜0.05)。與con 組相比，AR 組心肌細(xì)胞LDH活性顯著增加(P＜0.05)，不同濃度異氟烷可顯著抑制由AR 損傷導(dǎo)致的LDH活性升高(P＜0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度異氟烷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響Fig1 Effects of different concentrations of isoflurane on cell viability and LDH activity in AR-injured HCM cells(n=5)

圖2 不同濃度異氟烷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig2 Effects of different concentrations of isoflurane on cell apoptosis in AR-injured HCM cells(n=5)

2.2 異氟烷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響

AR 組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于con組(P＜0.05)。異氟烷可對(duì)AR 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生劑量依賴性抑制作用，其中1%、1.5%和2%異氟烷組細(xì)胞凋亡率顯著低于AR組(P＜0.05)(圖2)。

2.3 異氟烷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

AR 組HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著高于con組(P＜0.05)。異氟烷可上調(diào)AR 損傷心肌細(xì)胞中HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平，其中1.5%和2%的異氟烷與AR 組之間具有明顯差異(P＜0.05)(圖3)。

圖3 不同濃度異氟烷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α表達(dá)的影響Fig3 Effects of different concentrations of isoflurane on the expression of HIF-1α in AR-injured HCM cells(n=5)

2.4 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響

與AR 組和scramble 組相比，siRNA轉(zhuǎn)染組HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)。在siRNA 和2%異氟烷的共同作用下，心肌細(xì)胞HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著低于AR 組和scramble組(P＜0.05)(圖4)。

2.5 異氟烷對(duì)HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活力和LDH活性的影響

AR 組和scramble 組在2%異氟烷的作用下，心肌細(xì)胞活力和LDH活性均與con 組具有顯著差異。siRNA轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞活力(48.97%±7.39%)顯著低于con組、AR 組和scramble組(P＜0.05)，而LDH活性顯著高于con組、AR 組和scramble組(P＜0.05)(圖5)。

2.6 異氟烷對(duì)HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響

AR 組和scramble 組心肌細(xì)胞凋亡率均較低，與con 組無顯著差異。而siRNA轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞的凋亡率顯著高于con組、AR 組和scramble組(P＜0.05)(圖6)。

圖4 siRNA轉(zhuǎn)染后缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1α 基因的表達(dá)Fig4 The expression of HIF-1α in AR-injured HCM cells transfected with HIF-1α siRNA

圖5 異氟烷對(duì)低氧誘導(dǎo)因子-1α siRNA轉(zhuǎn)染后缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響Fig5 Effects of isoflurane on cell viability and LDH activity in AR-injured HCM cells transfected with HIF-1α siRNA(n=5)

3 討論

揮發(fā)性麻醉藥異氟烷可保護(hù)缺血再灌注損傷的腦、腎和肺，其機(jī)制可能是通過HIF-1α 細(xì)胞信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[7-10]。缺血再灌注可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡損傷心臟的功能，而異氟烷可通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 家族和下調(diào)caspase-3 蛋白和促凋亡Bax的表達(dá)抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明提高細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞凋亡可保護(hù)AR 對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，這種保護(hù)作用可能是通過抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放和caspase-3的激活[3]來實(shí)現(xiàn)的。乙醛脫氫酶2的磷酸化在異氟烷預(yù)處理的心肌保護(hù)作用中也具有十分重要的作用[12]。

本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，異氟烷可顯著上調(diào)AR 損傷心肌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)水平。應(yīng)用HIF-1α siRNA 沉默HIF-1α的表達(dá)，檢測(cè)了異氟烷對(duì)AR 損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)在HIF-1α表達(dá)沉默的情況下，異氟烷對(duì)AR 損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用顯著減弱甚至消失，表明HIF-1α 在異氟烷對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用中具有十分重要的作用。HIF-1α 可激活調(diào)節(jié)缺氧/缺血反應(yīng)的蛋白產(chǎn)物如紅細(xì)胞生成素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、NOS 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等基因的轉(zhuǎn)錄[13]。HIF-1α 可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷，其機(jī)制主要是通過對(duì)細(xì)胞代謝從氧化磷酸化到有氧糖酵解的重編程，并降低IR 損傷過程中線粒體氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制MPTP的開放，同時(shí)，HIF-1α 下游效應(yīng)因子已糖激酶Ⅱ也可阻止IR損傷過程中的線粒體的功能障礙[2]。

綜上所述，本結(jié)果表明HIF-1α表達(dá)上調(diào)在異氟烷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)中具有十分重要的作用。

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