Y-27632抑制胃癌SGC-7901細胞系侵襲與轉移

趙 敏，周 穎，黃江梅，肖 芳，李曉超，張 輝，劉瑞吉

(秦皇島市第一醫(yī)院 病理科，河北 秦皇島066000)

胃癌是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率有明顯上升的趨勢。血清應答因子(serum response factor，SRF)是一個重要的轉錄因子，調控涉及細胞增殖、遷移、分化、血管發(fā)生和凋亡等方面的多種基因的表達。最近研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌、大腸癌和甲狀腺癌組織中高表達，可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉移。SRF 自身轉錄活性相對較低，需與輔因子結合后發(fā)揮調控靶基因的作用。MRTF-A (myocardin-like protein 1)是SRF 重要的輔因子之一。Rho 相關卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated coiled coil protein kinase，ROCK)通過Rho 信號傳導通路激活MRTF 信號，促進MRTF-A(MAL)轉位入核，激活SRF 依賴的轉錄[1-3]。Y-27632是ROCK 特異性通路阻斷劑，研究表明其對細胞黏附、張力纖維形成及肌動球蛋白依賴的細胞運動具有調控作用。本研究檢測ROCK 阻斷劑Y-27632對胃癌SGC-7901細胞系增殖和遷移的影響，并研究其作用機制是否是通過對SRF 調控來實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 材料

SGC-7901 胃癌細胞系(中科院上海細胞庫)。siRNA、RNAi-Mate 轉染試劑(上海吉瑪制藥技術有限公司)。Y-27632(Cayman 公司)。ROCK1(EPIT MICS 公司)。E-cadherin、β-catenin、F-actin、MRTFA 和Cyclin D1(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌SGC-7901細胞系的常規(guī)培養(yǎng)、轉染及實驗分組:用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2濃度、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞系。每2～3 天傳代1次。取對數(shù)增殖期細胞，按1.5×104/孔接種在96 孔培養(yǎng)板上，60 mm 培養(yǎng)瓶細胞調整為1.0×106/瓶。在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)至96孔板及60 mm 培養(yǎng)瓶中癌細胞匯合率應達到70%～80%。0.2%胎牛血清同步化24 h。按照上海吉瑪制藥技術有限公司《RNAi 產(chǎn)品使用手冊》進行轉染，siRNA-SRF 基因序列:正義5'-GCAAGGCACUGAUUCAGACTT-3'，反義5'-GUCUG AAUCAGUGCCUUGCTT-3'。轉染條件詳見表1。細胞在37℃、5% CO2濃度、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進行分組。

表1 不同細胞培養(yǎng)環(huán)境的轉染條件Table1 The condition of transfection in different cell-culture circumstance

將細胞分為:1)對照組:無血清培養(yǎng)基;2)Y-27632 通路阻斷劑組:無血清培養(yǎng)基+Y-27632(10、20 和30 μmol/L;3)siRNA-SRF-1107 干擾組:無血清培養(yǎng)基+siRNA。各組均孵育48 h。

1.2.2 CCK-8 法檢測增殖情況:各組細胞加入10 μL/孔CCK-8;37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h;用酶標儀測定450 nm 吸光度值，并計算抑制率(抑制率=1 －實驗組OA值/空白對照組OA值×100%)。

1.2.3 侵襲實驗:在Transwell 小室濾膜上加入75 μL matrigel(0.5 mg/mL)。收集各組細胞，離心重懸調整細胞為1×105cell/mL，在Transwell 小室上層加入200 μL 單細胞懸液，下室沿側壁加入600 μL含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。取出小室，小心去除濾膜表面未穿膜的細胞。乙醇固定，HE染色。鏡下計數(shù)侵襲細胞數(shù)，取5個視野的平均值。以侵襲細胞的相對數(shù)目反映細胞的侵襲能力。

1.2.4 劃痕實驗:制備各組細胞懸液，按照4×105cell/孔種植于24孔板。待細胞匯合后，超凈臺內用200 μL 槍頭在細胞表面劃痕，盡量保持筆直。按照實驗設計誘導，每組設6個復孔。48 h后鏡下觀察，照相，進行定性分析。

1.2.5 Western blot檢測:提取各組蛋白，按BCA法測定蛋白濃度。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。再將蛋白轉移至醋酸纖維素膜(PVDF)膜上。37℃搖動封閉1 h后，滴加封閉液稀釋的一抗，4℃過夜。充分洗滌后，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1 h。充分洗滌后，加入BCIP/NBT 顯色劑顯色。用掃描儀對PVDF膜上蛋白表達條帶進行掃描，經(jīng)Image J 圖像分析軟件測量條帶的OA值，以目的蛋白OA值/內參蛋白OA值比值的均值±標準差(±s)來表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0 軟件處理，主要統(tǒng)計指標進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的各個統(tǒng)計指標均以均數(shù)±標準差(±s)表示。多組間統(tǒng)計學差異顯著性采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD 法。

2 結果

2.1 不同濃度Y-27632對胃癌SGC-7901細胞系增殖的影響

分別予以胃癌SGC-7901細胞系10、20 和30 μmol/L Y-27632 孵育，隨著Y-27632濃度的增高，細胞增殖略有下降，抑制率分別為4.1%、7.2%和15.3%，而針對SRF的siRNA轉染組細胞增殖受限(P＜0.05)。在10～30 μmol/L 范圍內Y-27632對胃癌SGC-7901細胞增殖沒有影響(表2)。選擇20 μmol/L Y-23762 進行后續(xù)實驗研究。

2.2 Y-27632對胃癌SGC-7901細胞系侵襲能力和遷移能力的影響

與對照組相比，Y-27632 能夠顯著抑制腫瘤細胞的侵襲，與siRNA-SRF-1107 組具有類似的效應，侵襲細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。Y-27632和siRNASRF 均能顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移能力(P＜0.05)(表3，圖1)。

表2 Y-27632對SGC-7901細胞系增殖的影響Table2 The effect of Y-27632 on proliferation of SGC-7901 cells

表3 Y-27632對SGC-7901細胞系侵襲能力的影響Table3 The effect of Y-27632 on invasion of SGC-7901 cells(±s，n=6)

表3 Y-27632對SGC-7901細胞系侵襲能力的影響Table3 The effect of Y-27632 on invasion of SGC-7901 cells(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with blank control.

groups cell count blank control 149±19 Y-27632 56±17*siRNA-SRF-1107 56±15*

圖1 Y-27632對SGC-7901細胞系侵襲能力和遷移能力的影響Fig1 The effect of Y-27632 on invasion and motility of SGC-7901 cells (×100)

2.3 Western blot檢測ROCK1、SRF、E-cadherin、F-actin、MRTF-A、β-catenin 和Cycling D1的表達

用20 μmol/L Y-27632 能顯著下調胃癌SGC-7901細胞的ROCK1表達，相對表達量為對照組的37.0 %(P＜0.05)(圖2，表4)。

圖2 Y-27632和siRNA-SRF 對SGC-7901細胞系ROCK1 和SRF表達的影響Fig2 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on ROCK1 and SRF expressions in SGC-7901 cells

表4 Y-27632和siRNA-SRF 對SGC-7901細胞系ROCK1、SRF、E-cadherin、F-actin、MRTF-A、β-catenin和Cyclin D1表達的影響Table4 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on ROCK1，SRF，E-cadherin，F(xiàn)-actin，MRTF-A，β-catenin and Cyclin D1 expressions in SGC-7901 cells(±s，n=6)

表4 Y-27632和siRNA-SRF 對SGC-7901細胞系ROCK1、SRF、E-cadherin、F-actin、MRTF-A、β-catenin和Cyclin D1表達的影響Table4 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on ROCK1，SRF，E-cadherin，F(xiàn)-actin，MRTF-A，β-catenin and Cyclin D1 expressions in SGC-7901 cells(±s，n=6)

＊P＜0.05 compared with blank control.

group ROCK1 SRF E-cadherin F-actin MRTF-A β-catenin Cycling D1 blank control 0.99±0.04 1.00±0.07 0.96±0.05 1.02±0.12 1.06±0.06 1.02±0.02 0.99±0.07 Y-27632 0.37±0.01* 0.63±0.06* 2.64±0.63* 0.64±0.09* 0.47±0.15* 1.04±0.12 0.98±0.18 siRNA-SRF-1107 0.92±0.09 0.37±0.10* 2.74±0.35* 0.65±0.03* 0.54±0.20* 0.61±0.07* 0.47±0.13*

Y-27632 能顯著下調胃癌SGC-9701細胞SRF蛋白的表達，相對表達量為對照組的62.7%(P＜0.05);siRNA-SRF 轉染組中SRF的相對表達量為對照組的36.9%(P＜0.05)。而Y-27632 干預組SRF的相對表達量高于siRNA轉染組(P＜0.05)。

應用20 μmol/L Y-27632 能夠顯著上調E-cadherin的表達，是對照組的2.64倍(P＜0.05)。siRNA-SRF 轉染組也具有類似效應(圖3，表4)。

與相應對照組相比Y-27632 能夠顯著下調F-actin和MRTF-A的表達(P＜0.05)。siRNA-SRF轉染組也具有類似效應(圖3，表4)。

應用siRNA-SRF 能顯著抑制β-catenin的表達，其相對表達量為對照組的61.0%(P＜0.05)。同時siRNA-SRF 能夠顯著下調胃癌SGC-9701細胞Cyclin D1蛋白的表達，其相對表達量是空白對照組的47.3%(P＜0.05)(圖4，表4)。

圖3 Y-27632和siRNA-SRF 對SGC-7901細胞系E-cadherin，F(xiàn)-actin 和MRTF-A表達的影響Fig3 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on E-cadherin，F(xiàn)-actin and MRTF-A expressions in SGC-7901 cells

圖4 Y-27632和siRNA-SRF 對SGC-7901細胞系β-catenin 和cyclin D1表達的影響Fig4 The effect of Y-27632 and siRNA-SRF on non-phospho β-catenin and cyclin D1 expressions in SGC-7901 cells

3 討論

血清應答因子是屬于MADS 盒家族的轉錄因子，能夠參與調控細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞進程。研究表明SRF是調控細胞分化和細胞周期的重要轉錄因子[4-8]，SRF 能夠通過調控E-cadherin/β-catenin 復合物來促進腫瘤的增殖和轉移。本研究發(fā)現(xiàn)基因沉默SRF 能夠上調E-cadherin的表達，同時下調β-catenin的表達。上調E-cadherin的表達，使細胞運動性減弱，相應其侵襲和遷移能力被阻遏。Wnt/β-catenin信號能夠激活下游靶基因的轉錄活性，促進細胞增殖和分化[9-10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，β-catenin 下調，伴隨Cyclin D1表達的下調，使細胞周期停滯于G1期，細胞增殖受抑。因此，SRF 可能是通過調節(jié)E-cadherin/β-catenin的表達，從而調控胃癌SGC-7901細胞的遷移能力和增殖能力，基因沉默SRF 能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，并抑制其侵襲和遷移的能力。

RhoA 信號通路是激活核內SRF表達的重要信號傳導通路之一，能夠促進生長相關基因和細胞周期基因的轉錄。SRF 自身轉錄活性相對較低，需與輔因子結合后發(fā)揮調控靶基因的作用。myocardin轉錄因子(myocardin-related transcription factors，MRTF)是SRF 重要的輔因子之一，包括MRTF-A，也被稱為心肌樣蛋白1 (myocardin-like protein 1，MKL1)和MRTF-B(也被稱為MKL2)。研究表明Rho 信號傳導通路能夠激活MRTF 信號，活化的Rho 激活下游效應因子如ROCK，促進細胞內肌動蛋白絲形成，使球狀肌動蛋白(G-actin)聚合成為(纖)絲狀肌動蛋白F-actin，同時G-actin 與MRTF-A(MAL)解聚，MRTF-A(MAL)轉位入核，激活SRF 依賴的轉錄[1-3]。Y-27632是ROCK 特異性通路阻斷劑。近來研究發(fā)現(xiàn)Y-27632 具有抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的效應。本研究發(fā)現(xiàn)，Y-27632 能夠抑制胃癌SGC-7901細胞系的侵襲能力和遷移能力，Transwell 小室和劃痕實驗都顯示應用20 μmol/L的Y-27632后，與空白對照組相比，細胞穿透matrigel基底膜的數(shù)目減少，提示其侵襲能力減弱;劃痕實驗提示Y-27632 能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移能力。由于Y-27632是ROCK 特異性通路阻斷劑，因此Y-27632對腫瘤細胞的這種抑制侵襲和遷移能力可能與Rho 信號通路相關。本研究還顯示，應用Y-27632 僅對胃癌SGC-7901細胞侵襲和遷移能力具有抑制作用，而對細胞增殖無影響，然而基因沉默SRF 細胞增殖顯著受限，提示Y-27632 可能部分影響或抑制SRF 轉錄活性，或者說并不是通過直接抑制SRF的表達而發(fā)揮作用的。本研究表明，E-cadherin通過β-catenin 與細胞骨架結合，能夠促進同型細胞之間的黏附，使上皮細胞保持緊密連接。近來研究表明，E-cadherin表達的下調能夠激活MRTF-A(MAL)/SRF 信號，促進SRF的轉錄，使腫瘤細胞獲得間質表型[11-12]。而這種由E-cadherin 下調介導SRF的激活可以受到RhoA/ROCK 和其他信號傳導通路的調控[13-14]。Y-27632 能夠上調E-cadherin的表達，同時阻斷ROCK信號能夠抑制G-actin聚合為F-actin，相應抑制G-actin 與MRTF-A的解離，表現(xiàn)在Y-27632 干預組MRTF-A表達水平下調。而SRF 自身轉錄活性較低，缺乏輔因子MRTF-A的協(xié)同作用，最終導致SRF 轉錄水平的下調，產(chǎn)生與siRNA-SRF 相類似的結果。說明Y-27632 可能并不是通過直接抑制SRF的轉錄，而是通過抑制輔因子MRTF-A的表達下調SRF 轉錄水平，從而實現(xiàn)抑制胃癌SGC-7901細胞系侵襲和遷移能力的效應。

綜上所述，SRF 通過調節(jié)E-cadherin/β-catenin的表達，增強胃癌SGC-7901細胞的遷移、侵襲和增殖能力。Y-27632 能夠上調E-cadherin的表達，同時阻斷ROCK信號抑制SRF 輔因子MRTF-A的表達，進而下調SRF 轉錄水平，發(fā)揮其拮抗胃癌SGC-7901細胞的遷移和侵襲的作用。

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