高遷移率族蛋白B1參與心肺復(fù)蘇術(shù)后大鼠海馬組織P38MAPK信號通路的激活

侯安然，康秀文，陳曉兵，王言理，劉克喜

(連云港市第一人民醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)室，江蘇 連云港222002)

心搏驟停(sudden cardiac arrest，SCA)是威脅人類生命健康的重大問題[1]。隨著心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)技術(shù)不斷規(guī)范化，CPR 成功率得到一定的提高，但自主循環(huán)恢復(fù)(restoration of spontaneous circulation，ROSC)后的患者存活狀況并沒有改善，大約68%院外和23%院內(nèi)SCA患者死于腦損傷[2]，近年關(guān)于CPR 術(shù)后腦組織炎性損傷研究倍受關(guān)注[3-4]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)作為新的關(guān)鍵性炎性介質(zhì)在腦出血、腦卒中及腦膜炎患者的外周血和腦脊液中顯著升高[5-7]。HMGB1 在CPR 術(shù)后患者的腦脊液和血液中表達(dá)水平顯著升高[8]。但對CPR 術(shù)后腦組織HMGB1表達(dá)規(guī)律及作用目前尚未見相關(guān)研究報道。本研究用窒息法復(fù)制大鼠SCA模型，通過檢測CPR 術(shù)后大鼠海馬組織不同時間點HMGB1表達(dá)和P38激酶活性變化，同時觀察相應(yīng)時間點病理學(xué)改變及腦組織含水量的變化，初步探討HMGB1 在CPR 術(shù)后大鼠海馬組織激活P38MAPK信號通路的作用，為減輕CPR 術(shù)后腦炎性損傷的靶向性治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級、雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為200～280 g(徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號:蘇SCXK2010-0003);Trizol 試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根公司);HMGB1 引物(上海生物工程公司);RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔鼠IgG 和BCIP/NBT顯色試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所);兔抗大鼠HMGB l 抗體(Abcam 公司)，兔抗鼠Phospho-P38和P38 抗體(Cell Signalling 公司);兔抗大鼠β-actin抗體(中國南京巴傲德生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組、模型制備及標(biāo)本留取:采用隨機數(shù)字表法隨機分為2 組:假手術(shù)組(n =6)和復(fù)蘇組(按復(fù)蘇后2、6、12、24 和48 h 各時間點分5 亞組，n=6，共計30只)。大鼠補充標(biāo)準(zhǔn):假手術(shù)組、復(fù)蘇組在留取標(biāo)本之前發(fā)生死亡的，該動物的實驗數(shù)據(jù)無效，則另進(jìn)行補充實驗，以滿足每個亞組實驗數(shù)據(jù)6 只。模型復(fù)制:參考文獻(xiàn)[9]。假手術(shù)組大鼠操作成功(僅行麻醉、氣管插管和動靜脈置管)20 min后留取靜脈血5 mL，斷頭留取腦組織。復(fù)蘇組在模型復(fù)制成功后于各時間點留取標(biāo)本:麻醉后取下腔靜脈血5 mL，并斷頭處死，取右側(cè)大腦(去除海馬)吸干腦組織表面血漬;取左側(cè)海馬，－80℃保存;取右側(cè)海馬放4%多聚甲醛固定備用。

1.2.2 光鏡下觀察海馬組織病理變化:海馬(右)常規(guī)進(jìn)行HE染色。以假手術(shù)組海馬組織病理變化為參照，觀察各時間點復(fù)蘇組海馬組織病理變化。

1.2.3 腦組織含水量測定:稱腦組織濕重后以90～100℃恒溫烤箱烘烤48 h，烤至恒重[10]，稱干重。按腦組織含水量=(1 －干重/濕重)×100%計算。

1.2.4 RT-PCR 法檢測大鼠海馬組織HMGB1 mRNA表達(dá):按照RT-PCR 試劑盒操作說明書操作，引物序列(表1)。

表1 RT-PCR引物序列及條件Table1 RT-PCR primers and conditions

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠海馬組織HMGB l 和P38 蛋白表達(dá):按照RIPA 裂解液說明書提取蛋白，BCA法定量蛋白。配制12%分離膠，5%濃縮膠，樣品上樣量為5 μL(約30 μg)，80 V電泳30 min，120 V 電泳至溴酚藍(lán)到膠底，轉(zhuǎn)膜300 mA(60 min)，室溫下封閉90 min，加一抗4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫下孵育90 min，洗膜、BCIP/NBT 顯色。掃描后用目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶吸光度比值均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS l6.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組計量資料間的多重比較采用LSD;若方差不齊采用隨機區(qū)組設(shè)計的秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 海馬組織病理切片結(jié)果

假手術(shù)組(圖1A)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完好，圓形或橢圓形，核染色較淡，染色質(zhì)分布較均勻，尼氏體分布正常，未見細(xì)胞腫脹及變性壞死等病理改變。復(fù)蘇組海馬組織存在缺血性病理改變，隨著ROSC時間延長光鏡下細(xì)胞周圍間隙出現(xiàn)增寬，形態(tài)不規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)疏松，間質(zhì)水腫，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，尼氏體邊聚或消失，核固縮，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死(圖1B～D)，以ROSC后24 h 最為顯著(圖1E)，ROSC后48 h水腫減輕，但損傷仍較重，間質(zhì)膠質(zhì)纖維增多(圖1F)。

2.2 大鼠腦組織含水量測定

2.3 大鼠海馬組織HMGB1mRNA表達(dá)變化

與假手術(shù)組比較，復(fù)蘇組ROSC后2、6、12、24和48 h的海馬組織HMGB1 mRNA表達(dá)量明顯增高(P＜0.01)，其中24 h 為峰值(P＜0.01)，在48 h 略下降(P＜0.01)(圖2)。

圖1 假手術(shù)組、復(fù)蘇組各時間點海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化Fig1 Pathologic change of hippocampus tissue in shame-operated group and CPR group at each time point(×400)

表2 各組腦組織含水量Table2 Brain water content in each group (±s，n=6)

表2 各組腦組織含水量Table2 Brain water content in each group (±s，n=6)

#P＜0.01 compared with shame-operated group;*P＜0.01 compared with CPR group before a point in time.

group brain water content/%shame-operated group 77.03±0.47 CPR group/(hours)2 78.36±0.09#6 78.62±0.04#*12 79.19±0.10#*24 79.51±0.06#*48 78.80±0.05#*

2.4 大鼠海馬組織HMGB l表達(dá)變化

與假手術(shù)組比較，復(fù)蘇組ROSC后2 h 蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，ROSC后12、24 和48 h HMGB1表達(dá)量均逐漸增高，24 h 達(dá)到峰值(P＜0.01)，48 h 稍下降(圖3)。

2.5 大鼠海馬組織P38 活性變化

與假手術(shù)組比較，復(fù)蘇組海馬組織p-P38 蛋白表達(dá)于ROSC后2 h表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，6 h達(dá)到高峰(P＜0.01)，在12、24 和48 h表達(dá)緩慢下降(P＜0.01)(圖4)。

圖2 假手術(shù)組、復(fù)蘇組各時間點海馬組織HMGB1 mRNA表達(dá)Fig2 HMGB1mRNA change of hippocampus tissue in shame-operated group and CPR group at each time point(±s，n=6)

圖3 假手術(shù)組、復(fù)蘇組各時間點海馬組織HMGB1表達(dá)Fig3 HMGB1 change of hippocampus tissue in shameoperated group and CPR group at each time point (±s，n=6)

圖4 假手術(shù)組、復(fù)蘇組各時間點海馬組織p-P38 蛋白表達(dá)Fig4 p-P38 change of hippocampus tissue in shameoperated group and CPR group at each time point (±s，n=6)

3 討論

SCA后的腦損傷是患者獲得初期CPR 術(shù)成功后最終生存率一直處于低水平的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇組ROSC后腦組織含水量增加顯著，表明腦組織水腫明顯。病理切片顯示復(fù)蘇組ROSC后海馬組織存在缺血病理改變，該病理學(xué)改變符合腦缺血再灌注損傷的改變。以上均說明復(fù)制模型成功，并提示CPR 術(shù)后大鼠發(fā)生了嚴(yán)重的腦損傷。

HMGB1是一種真核細(xì)胞內(nèi)含量豐富的非組DNA 結(jié)合蛋白。近年來研究表明HMGB1 一旦釋放到胞外則扮演一種內(nèi)源性危險信號，HMGB1 可以從壞死的細(xì)胞中被動釋放充當(dāng)炎性反應(yīng)早期的啟動者[11]，激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞主動分泌HMGB1，主動分泌的HMGB1 又可以激活免疫細(xì)胞等分泌HMGB1 和其他炎性介質(zhì)，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)不斷促進(jìn)炎性反應(yīng)的級聯(lián)放大，由此可見HMGB1 在炎性反應(yīng)瀑布中處于中心環(huán)節(jié)。本研究顯示CPR 術(shù)后大鼠海馬組織HMGB1表達(dá)于ROSC后2 h 降低，而后逐漸上升，24 h 達(dá)到高峰，在48 h 略下降，但仍高于正常水平。本研究與既往研究報道類似。不同之處本研究ROSC后2 h HMGB1表達(dá)量降低，而既往研究則為2 h時HMGB1 升高，分析原因可能為制作動物模型方式不同和缺血時間長短不同[12]。SCA 所致為全腦缺血缺氧，其缺血面積及損傷程度更為顯著，在CPR 術(shù)后早期階段，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等出現(xiàn)缺血受損或壞死，HMGB1 迅速從胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)被動釋放至胞外，而后釋放出來的HMGB1 可近一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞進(jìn)一步主動釋放HMGB1 和其他炎性因子，共同介導(dǎo)CPR 術(shù)后腦炎性損傷。以上研究均提示HMGB1是觸發(fā)CPR 術(shù)后腦缺血早期炎性反應(yīng)的上游始動因子。HMGB1 基因表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢，在48 h 略有下降，與蛋白表達(dá)趨勢類似。

P38MAPK (mitogen-activated protein kinase，MAPK)是MAPK信號通路主要成員之一，在炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用[13]。p-P38MAPK 誘導(dǎo)許多重要炎性因子釋放如IL-1β、TNF-α 和HMGB1 等[14]。P38MAPK信號通路在腦缺血的炎性損傷中發(fā)揮著重要作用[15]。本研究表明CPR 術(shù)后誘導(dǎo)HMGB1 規(guī)律表達(dá)的同時發(fā)生了P38 磷酸化，提示HMGB1 參與CPR 術(shù)后大鼠海馬組織P38MAPK信號通路的激活。本研究中復(fù)蘇組海馬組織p-P38 蛋白表達(dá)在ROSC后2 h表達(dá)顯著升高，6 h 達(dá)到高峰，以上均表明P38MAPK在腦缺血早期階段就參與了腦炎性損傷過程。

綜上所述，本研究顯示CPR 術(shù)后早期階段被動釋放的HMGB1 作為一種重要的炎性細(xì)胞因子激活P38MAPK信號通路，P38 被磷酸化形成p-P38，進(jìn)而可能通過直接或間接作用活化相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，在基因水平上調(diào)控HMGB1表達(dá)。HMGB1mRNA表達(dá)明顯增加也支持以上結(jié)論。這可能是CPR 術(shù)后HMGB1表達(dá)的一重要機制，該機制可能在腦缺血再灌注的炎性損傷發(fā)揮重要作用。針對該機制的靶向治療有可能為減輕CPR 術(shù)后腦炎性損傷治療提供新的線索。但該信號通路中具體轉(zhuǎn)錄因子激活及HMGB1 基因表達(dá)的調(diào)節(jié)均有待進(jìn)一步研究證實。

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