IL-31對人支氣管上皮16HBE細(xì)胞VEGF、EGF及EGFR表達(dá)的影響及作用機(jī)制

黃海良，丁偉偉，張勝權(quán)，羅 欣

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽 合肥230032;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥230031)

白細(xì)胞介素-31(interleukin-31，IL-31)屬于IL-6家族成員，主要由激活的CD4+Th2細(xì)胞所產(chǎn)生，主要生物學(xué)功能包括調(diào)控炎癥及免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子分泌及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化。最近的研究表明，IL-31 與呼吸系統(tǒng)疾病，例如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺疾病(COPD)等的氣道炎性反應(yīng)和氣道重塑密切相關(guān)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究IL-31對人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、細(xì)胞表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的影響及作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究其參與氣道重塑的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為氣道重塑的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

16HBE細(xì)胞(上海博谷生物科技有限公司);IL-31(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司);RNA 提取試劑盒和real-time PCR 試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fish 公司);RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco 公司);β-actin、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK 和p-JNK抗體(Santa Cruz 公司)。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)

熒光定量PCR引物由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成(表1)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

使用RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，待細(xì)胞增殖至匯合度為80%～90%時(shí)，棄培養(yǎng)液并用無菌PBS 清洗2次，然后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞3 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為80%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基。

表1 Real-time PCR引物Table1 Primer sequences of real-time PCR

用0、1、10、100 和500 ng/mL的IL-31 處理16HBE細(xì)胞24 h，real-time PCR檢測VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表達(dá)。選取100 μg/L的IL-31 分別處理16HBE細(xì)胞0、3、6、12、24 和48 h 以及0、5、15、30 和60 min，用real-time PCR檢測VEGF、EGF和EGFR mRNA的表達(dá)及Western blot檢測P38 MAPK 和JNK磷酸化水平。用100 μg/L的IL-31單獨(dú)及分別聯(lián)合 SB203580 (10 μmol/L)或SP600125(2 μmol/L)處理16HBE細(xì)胞24 h，應(yīng)用real-time PCR 和Western blot 分別檢測VEGF、EGF和EGFR mRNA 和蛋白水平的變化。IL-31 與抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制劑先于IL-31 1 h 加入。

1.4 Real-time PCR檢測VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表達(dá)

無菌PBS 洗滌16HBE細(xì)胞3次，按RNA 提取試劑盒操作說明書提取細(xì)胞總RNA。以RNA 為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成。以cDNA 為模板ABI7500 real-time PCR 儀上檢測VEGF、EGF 和EGFR mRNA表達(dá)，同時(shí)以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2－△△Ct法進(jìn)行比較分析。realtime PCR 反應(yīng)程序如下:95℃15 s，60℃1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

1.5 Western blot檢測VEGF、EGF、EGFR 及P38 MAPK、JNK信號(hào)通路的變化

用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后，按50 μg /孔的量加樣、電泳。150 mA、2 h分別將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2 h?？筕EGF、EGF、EGFR、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK 和p-JNK 抗體分別按1 ∶500 稀釋，抗β-actin 抗體按1∶1 000 稀釋，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，每次5 min，相應(yīng)二抗按1∶10 000 進(jìn)行稀釋，室溫孵育2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min，ECL 發(fā)光、顯影、定影。以β-actin 作為內(nèi)參，分析各目的蛋白/β-actin的吸光度比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較使用One-way ANOVA 和t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-31對VEGF、EGF 和EGFR mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，濃度為10、100 和500 μg/L的IL-31 均顯著上調(diào)VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表達(dá)(P＜0.01)(圖1A)，而100 μg/L的IL-31 干預(yù)3、6、12、24 和48 h 均顯著促進(jìn)VEGF、EGF 和EGFR mRNA的表達(dá)(P＜0.01)(圖1B)。

圖1 IL-31對16HBE細(xì)胞VEGF、EGF 和EGFR mRNA表達(dá)的影響Fig1 Effects of IL-31 on the mRNA expression of VEGF，EGF and EGFR in 16HBE cells(±s，n=6)

2.2 IL-31對16HBE細(xì)胞P38 MAPK 和JNK磷酸化水平的影響

與對照組相比，100 μg/L的IL-31 干預(yù)16HBE細(xì)胞5 min后即可明顯促進(jìn)P38 MAPK 和JNK磷酸化的表達(dá)水平，其中IL-31 干預(yù)5、15 和30 min(P＜0.01)，IL-31 干預(yù)60 min(P＜0.05)(圖2)。

圖2 IL-31對16HBE細(xì)胞P38 MAPK 和JNK磷酸化表達(dá)的影響Fig2 Effects of IL-31 on the phosphorylation expression of P38 MAPK and JNK

2.3 特異性信號(hào)通路阻斷劑對IL-31激活的信號(hào)通路的影響

與對照組相比，IL-31 可顯著促進(jìn)P38 MAPK 和JNK磷酸化的表達(dá)水平(P＜0.01);與IL-31 組相比，IL-31+SB203580 或SB203580 組p-P38 MAPK的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.01)，而IL-31+SP600125 或SP600125 組p-JNK的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.01)(圖3)。

圖3 特異性信號(hào)通路阻斷劑對IL-31激活的信號(hào)通路的影響Fig3 Effects of Specific inhibitors on IL-31-induced signal pathways

2.4 IL-31 分別聯(lián)合SB203580 或SP600125 對VEGF、EGF 和EGFR表達(dá)的影響

與對照組相比，IL-31 組VEGF、EGF 和EGFR 在mRNA 和蛋白水平均顯著升高(P＜0.01);與IL-31組相比，IL-31 分別聯(lián)合SB203580 或SP600125，VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)水平發(fā)生顯著下降(P＜0.01)，而EGF 和EGFR的表達(dá)水平在IL-31 聯(lián)合SB203580時(shí)顯著下降(P＜0.01)(圖4)。

圖4 IL-31 單獨(dú)及分別聯(lián)合SB203580 或SP600125 對VEGF、EGF 和EGFR 蛋白表達(dá)的影響Fig4 Effects of IL-31 on the protein expression of VEGF，EGF and EGFR with or without SB203580 or SP600125

3 討論

氣道重塑與氣道慢性炎性反應(yīng)、氣道上皮細(xì)胞增生、遷移以及氣道平滑肌細(xì)胞增生等密切相關(guān)。IL-31是機(jī)體重要的促炎癥性細(xì)胞因子，最近的研究表明IL-31 參與了哮喘氣道炎性反應(yīng)、氣道重塑，其作為炎性介質(zhì)介導(dǎo)了支氣管哮喘、COPD 等慢性呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。

VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖以及新生血管的生成等[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道黏膜組織VEGF、Flt-1 和Flk-1 mRNA的表達(dá)量顯著高于正常組，并且與氣道密度呈正相關(guān)[7]。EGF、EGFR是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的重要因子，對細(xì)胞增殖與分化起著重要作用[8-9]。研究表明，組胺在支氣管上皮細(xì)胞當(dāng)中能夠通過誘導(dǎo)EGFR 配體的表達(dá)進(jìn)而活化EGFR，參與氣道重塑[10]。同樣，有研究表明與正常小鼠相比，慢性哮喘小鼠肺組織中EGF 和EGFR的表達(dá)顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了EGF 和EGFR 在氣道損傷修復(fù)及氣道重塑中起著重要作用。此外，使用EGFR的阻滯劑吉非替尼可以抑制哮喘小鼠氣道黏液的分泌，提示EGFR 參與了哮喘杯狀細(xì)胞黏液的分泌、化生、抗凋亡的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致氣道上皮的異常增殖、氣道壁增厚及氣道重塑[11-12]。

P38 絲裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和c-JUN氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要參與調(diào)控機(jī)體炎性反應(yīng)、細(xì)胞周期，細(xì)胞發(fā)育、分裂和分化等[13-14]。研究表明，P38 MAPK信號(hào)通路參與了低氧預(yù)適應(yīng)小鼠的抗凋亡過程，對缺血腦組織損傷起到了保護(hù)作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-31 能夠上調(diào)16HBE細(xì)胞VEGF、EGF 和EGFR的表達(dá)，并具有劑量效應(yīng)，提示IL-31 可能參與了上皮細(xì)胞的炎性損傷-修復(fù)機(jī)制、介導(dǎo)了上皮細(xì)胞的增生，進(jìn)而介導(dǎo)了氣道重塑的發(fā)生。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，IL-31 可通過激活P38 MAPK 和JNK信號(hào)通路而誘導(dǎo)的VEGF 以及通過激活P38 MAPK信號(hào)通路而誘導(dǎo)EGF 和EGFR的表達(dá)。因此，推測IL-31 可通過激活P38 MAPK 和JNK信號(hào)通路進(jìn)而介導(dǎo)了氣道重塑的發(fā)生，為進(jìn)一步深入研究IL-31 在氣道重塑中分子生物學(xué)作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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