重組腺相關病毒表達干擾素α體外抑制乙肝病毒的復制

朱 江，高 蕾

(1.成都學院 醫(yī)護學院 病原免疫教研室，四川 成都610106;2.中國醫(yī)學科學院 輸血研究所，四川 成都610052)

中國是乙型肝炎的高流行區(qū)，一般人群乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)陽性率為7.18%[1]。目前，治療乙型肝炎的主要方法是干擾素和核苷類似物。使用的干擾素均是外源性干擾素，有很多乙肝患者對于干擾素不敏感，導致治療無效，且干擾素需要長期使用，增加了患者的負擔[2]。重組腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體被廣泛應用到基因治療和臨床前或臨床實驗中，嘗試著進行多種疾病的治療[3-4]。HepG2.2.15細胞能產(chǎn)生完整的HBV，穩(wěn)定分泌HBsAg 和HBeAg，常被作為體外評估抗HBV 藥物效果的細胞模型[5]。本實驗利用重組病毒AAV-IFN 感染HepG2.2.15細胞的方法，介導干擾素在體內(nèi)表達，產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素并對其抗病毒效果進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料:細胞及質粒:293T細胞、HepG2.2.15細胞、pAAV-IFN(將IFN 基因克隆于去除Rep 和Cap 基因的含有腺相關病毒6型TR 結構的pAAV骨架質粒中獲得)、Pxx680(輔助質粒)、Pxr2、Pxr6、Pxr7、pXR8(包裝質粒)、pSC-gfp (含有綠色熒光蛋白基因的質粒)和PCP10(含有2個拷貝HBV 基因組的質粒作為Q-PCR 進行HBV 定量的標準品)(中國醫(yī)學科學院輸血研究所輸血傳播疾病研究實驗室凍存)。

試劑:DMEM 高糖培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素(Hyclone 公司);血清(Gbico 公司);G418 和MTT 試劑盒(Sigma 公司);DNeasy blood＆ tissue kits(Qiagen 公司);人HBsAg ELISA 檢測試劑盒和人HBeAg ELISA檢測試劑盒(泉州市藍圖生物技術有限公司);小鼠ALT ELISA 檢測試劑盒和小鼠AST ELISA 檢測試劑盒(Quantikine? ELISA 公司);Fast Start Universal SYBR Green Master[Rox](Roche 公司);小鼠α 干擾素(IFNα)定量檢測試劑盒(R＆D 公司)。

1.1.2 小鼠:SPF級BABL/c 小鼠，雄性，8～10周齡，體質量(18±2)g[成都達碩實驗動物公司，合格證號:scxk(川)2013-24]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):293T細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(DMEM 加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素);HepG2.2.15細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基并加入終濃度為400 mg/L的G418;培養(yǎng)條件均為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 重組病毒的制備與純化:轉染的前1 d，將匯合度達到90%以上的293T細胞，5% CO2、37℃培養(yǎng)。當293T細胞匯合度達到80%～90%時按1∶3的比例分成3盤，接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)，利用3 質粒共轉染技術進行轉染，培養(yǎng)72 h 以后，收獲病毒。收獲的病毒利用氯化銫超速離心法進行純化。

1.2.3 重組病毒AAV-GFP 感染HepG2.2.15細胞:感染的前1 d，將HepG2.2.15細胞以4×104個/孔接種于6孔板。次日，吸取6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，將2、6、7 和8 血清型的AAV-GFP 以MOI =103的感染劑量，分別接種于HepG2.2.15細胞，孵育1 h，傾倒出感染液，加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察GFP 在細胞內(nèi)表達情況。

同時以質粒pSC-GFP 轉染HepG2.2.15細胞作為陽性對照，HepG2.2.15細胞接種初始4×104個/孔，質粒pSC-GFP 用量3μg，轉染試劑PEI 用量9 μg，轉染72 h，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況。

1.2.4 IFN 體內(nèi)和體外穩(wěn)定表達驗證:設置PBS 空白對照組、AAV-GFP 陰性對照組、pAAV-IFN 轉染陽性對照組和AAV6-IFN 實驗組。

AAV6-IFN 感染HepG2.2.15細胞，感染方法同上，感染劑量為MOI =104，分別于1，3，6和9 d 收獲培養(yǎng)上清，并利用ELISA 試劑盒測量上清中IFNα的表達量。

同時將AAV6-IFN 以5×1010μg/只的劑量，經(jīng)尾靜脈注射，在1、2、3 及6月取小鼠血液，將小鼠血液冰上放置30 min后，3 000 r/min 離心，收獲血清－20℃凍存?zhèn)溆?。全部樣本用ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中IFN表達情況、ALT(丙氨酸轉氨酶)和AST(天門冬氨酸轉氨酶)含量變化。

1.2.5 重組AAV6-IFN 病毒感染HepG2.2.15細胞:AAV6-IFN 感染HepG2.2.15細胞，感染劑量為MOI=104，于1，3，6和9 d 收獲各組培養(yǎng)上清及細胞。ELISA 試劑盒測量上清中HBsAg 和HBeAg的變化，并利用DNeasy blood ＆ tissue kits 提取培養(yǎng)上清和細胞中總DNA，qPCR 方法定量培養(yǎng)上清和細胞中HBV DNA 含量的變化。對HBV DNA 定量的qPCR 反應上游引物為5'-CGTTTTTGCCTTCTGACTT CTTTC-3'，下游引物為5'-ATAGGATAGGGGCATTTG GTGGTC-3'，擴增片段長度為372 bp;同時以質粒PCP10(包含2個拷貝的HBV 基因組的質粒)為標準品，進行10倍梯度稀釋，以1.0×103～1.0×109copy/mL繪制標準曲線。

1.2.6 MTT法檢測HepG2.2.15細胞增殖:取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，每孔接種4×104個。培養(yǎng)12 h后，洗掉培養(yǎng)液，換1% 胎牛血清的培養(yǎng)基同步化12 h。設置PBS 為空白對照組;AAV-GFP 為陰性對照組;pAAV-IFN 為轉染陽性對照組;AAV6-IFN 為實驗組。劑量同上，每組樣本設3個復孔，37℃、5% CO2孵箱分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀在波長570 nm 處測定A值，按以下公式計算抑制率:

抑制率=(空白對照組A值－實驗組A值)/空白對照組A值×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗動物采用SPSS 17.0 軟件，隨機分組進行體內(nèi)實驗，結果以小鼠測量值的平均值±標準差(±s)表示，組間比較使用方差分析。

2 結果

2.1 AAV6 可有效介導GFP 在HepG2.2.15細胞內(nèi)表達

在感染72 h后，AAV6-GFP(圖1B)較其他血清型AAV2-GFP(圖1A)，AAV7-GFP(圖1C)，AAV8-GFP(圖1D)，對于HepG2.2.15細胞有更強的感染效率。同時以PBS代替AAV-GFP 作為陰性對照(圖1F)，72 h后未見GFP表達;以質粒pSC-GFP 轉染HepG2.2.15細胞的陽性對照可明顯觀察到GFP表達(圖1E)。

圖1 不同血清型AAV-GFP 感染HepG2.2.15細胞后GFP的表達Fig1 Expression of GFP in HepG2.2.15 cells infected with different serotype AAV(×400)

2.2 重組AAV6-IFNα 介導IFN 在體內(nèi)外有效表達

AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15細胞3 d后，培養(yǎng)上清液中能檢測出IFNα的表達;持續(xù)感染9 d后，表達量可達(36.63±3.27)ng/mL;同時質粒pAAV-IFNα 轉染組培養(yǎng)上清中也檢測到IFN表達，但是IFNα表達量沒有AAV6-IFNα 感染組多(P＜0.01)(圖2A)。

將AAV6-IFNα 尾靜脈注射小鼠1個月后即可檢測出血清中IFNα 為(191±19)ng/mL，隨后血清中IFNα濃度保持穩(wěn)定，6個月時IFNα濃度降低了29.28%(圖2B)。

2.3 重組AAV6-IFNα 對肝功能指標ALT、AST的影響

注射AAV6-IFNα 6個月后小鼠血清中ALT 和AST 與對照PBS組和AAV6-GFP 組相對比沒有區(qū)別(圖2C，D)。

2.4 AAV6-IFNα體外顯著抑制HBV的復制與表達

對各組HepG2.2.15細胞表達HBV DNA 檢測顯示，培養(yǎng)9 d后AAV6-IFNα 組抑制率[(空白組-實驗組)/空白組×100%]可達40.13%(圖3A);而AAV6-IFNα 組對培養(yǎng)上清中HBV DNA的抑制效果在感染3 d時即逐漸呈現(xiàn)，在感染9 d時抑制率可達62.93%(圖3B)。同時測量培養(yǎng)上清中HBsAg 和HBeAg 含量變化，感染9 d后HBsAg 和HBeAg的抑制率分別為47.33%和37.49%(圖3C，D)。HBsAg的抑制效果在感染3 d 以后逐漸呈現(xiàn)，而HBeAg的抑制效果在感染6 d 以后逐漸呈現(xiàn)。AAV6-IFNα 組與轉染陽性對照組相比，對于HBV的復制和表達抑制效果更為明顯，持續(xù)時間更長(P＜0.05)。

圖2 AAV6 有效介導IFN 在體內(nèi)外表達且不引起急性反應Fig2 Expression of IFN mediated effectively by AAV6 with no acute inflammatory reaction in vivo and in vitro

圖3 AAV6-IFNα體外有效抑制HBV的復制與表達Fig3 The replication and expression of HBV inhibited by AAV-IFNα in vitro

2.5 AAV-IFN 抑制HepG2.2.15細胞增殖

AAV6-IFN 作用于HepG2.2.15細胞48、72 h后，可表現(xiàn)明顯的抑制作用，抑制率分別為35%、69%，并呈現(xiàn)時間依賴關系(圖4)。

圖4 AAV6-IFNα 對細胞增殖的抑制作用Fig4 The proliferation of HepG2.2.15 cells inhibited by AAV6-IFNα

3 討論

乙肝為高發(fā)傳染病，目前治療主要以干擾素及核苷類似物為主。干擾素的長期使用給患者帶來痛苦和金錢負擔。AAV 載體具有無致病性，低免疫原性，可介導外源基因長期表達等優(yōu)點，已嘗試用于多種疾病的治療[3-4]。本實驗嘗試用AAV 載體來介導IFNα的長期表達，從而減少IFNα 注射次數(shù)，減輕乙肝患者的痛苦。

不同AAV 血清型對組織的感染率不同，用重組AAV 轉染獼猴、小鼠和人的造血干細胞，發(fā)現(xiàn)AAV1 轉染小鼠造血干細胞的能力強，而AAV6 轉染人造血干細胞的能力強[6]，但采用AAV 對HepG2.2.15細胞的感染效率的評估鮮有報道。本實驗中發(fā)現(xiàn)AAV6 對于HepG2.2.15細胞具有更強的感染性，更適合作為體外介導IFN 在HepG2.2.15細胞內(nèi)表達的載體。

利用AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15細胞和尾靜脈注射小鼠的方法，在培養(yǎng)上清液和小鼠血清中均檢測到IFNα的表達，說明利用AAV 載體介導HepG2.2.15細胞表達IFN 具有可行性。模型小鼠在長達6個月內(nèi)均有IFN的表達，說明AAV6 載體可介導IFN 長期表達，體現(xiàn)了AAV6 作為載體的優(yōu)越性。同時實驗還對AAV6-IFN 安全性進行了檢測，注射AAV6-IFN 小鼠的血清中反應肝細胞損傷的指標ALT 和AST 變化均與對照組沒有顯著區(qū)別。

體外AAV6-IFNα 感染HepG2.2.15細胞，發(fā)現(xiàn)表達的內(nèi)源性IFNα 對HBV DNA、HBsAg 和HBeAg均有顯著的抑制作用，抑制率可達50%以上，與陽性對照質粒pAAV-IFN 轉染組相比，AAV6-IFNα 組抑制時間更長效果更顯著。

AAV6-IFNα 能顯著抑制HepG2.2.15細胞的增殖，并有時間依賴性，這可能是AAV6-IFNα 抑制HepG2.2.15細胞HBV 復制與表達的原因。因此，AAV6-IFNα是一種潛在的抗HBV 藥物。但是還需要進一步將AAV6-IFN 在乙型肝炎小鼠模型上進行抗病毒效果的評估，觀察其體內(nèi)抑制HBV的復制和表達的能力及機制，本研究為體內(nèi)實驗奠定堅實的基礎。

[1]胡曉麗，趙宏偉，胡曉巖，等.乙型肝炎病毒感染的流行現(xiàn)狀[J].臨床肝膽病雜志，2012:28:413-414.

[2]邱玉琴.慢性乙肝患者使用干擾素治療中不良反應的觀察與護理[J].醫(yī)學理論與實踐，2011:963-964.

[3]Flotte TR.Adeno-associated virus-mediated gene transfer for lung diseases[J].Hum Gene Ther，2005，16:643-648.

[4]Romano G.Current development of adeno-associated viral vectors[J].Drug News Perspect，2005，18:311-316.

[5]Tang J，Huang ZM，Chen YY，et al.A novel inhibitor of human la protein with anti-HBV activity discovered by structure-based virtual screening and in vitro evaluation[J].PLoS One，2012，7:1371-1379.

[6]Song LJ，Kauss MA，Kopin E，et al.Optimizing the transduction efficiency of capsid-modified AAV6 serotype vectors in primary human hematopoietic stem cells in vitro and in a xenograft mouse model in vivo[J].Cytotherapy，2013，15:986-989.