骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞

張夏夢(mèng)，壽折星，陳望隆，張繼紅，馬澤洪，任俊紅

(1.宜昌市第二人民醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，湖北 宜昌443000;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，湖北 武漢430022;3.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌443000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一類(lèi)病因尚未完全明確的腸道非特異性炎癥反應(yīng)性疾病。骨髓細(xì)胞是唯一的胃腸道以外來(lái)源的有助于腸上皮再生的細(xì)胞，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多分化潛能的細(xì)胞，在特定條件下能誘導(dǎo)分化形成各種非造血組織[1-2]，且具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠UC模型，旨在研究MSCs 向結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的分化情況，并通過(guò)檢測(cè)MSCs 移植對(duì)炎性因子白介素-4(interleukin-4，IL-4)及核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)表達(dá)的影響，為MSCs 移植治療炎性腸病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma 公司，P2297);大鼠SRY DNA 原位熒光雜交染色系統(tǒng)(天津市灝洋生物公司，RAT2009BIO);兔抗大鼠CK20 單克隆抗體(Abcam 公司，ab76126);NF-κB p65 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，sc-8000);濃縮型DAB 顯色劑(Bioss 公司，C-0010);羊抗小鼠IgG、SABC-Cy3 試劑盒(武漢博士德公司);SYBR Green 定量PCR 試劑盒(Roche 公司);大鼠白介素4 (IL-4)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特公司，E-EL-R0014)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證SCKY(鄂)2008-0005，No:4200696100;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明SYXK(鄂)2010-0057，No:00116132。3～4周齡雄性大鼠5只，體質(zhì)量(160±20)g，用于制備MSCs;6～8周齡雌性大鼠30只，體質(zhì)量(250±20)g，用于分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 MSCs的分離、傳代與鑒定

收集雄性大鼠骨髓細(xì)胞，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞留用。采用熒光標(biāo)記的CD29、CD90、CD45 及CD11b，用流式細(xì)胞學(xué)方法鑒定MSCs。

1.4 UC模型制備及干預(yù)

1.4.1 模型制備:用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇復(fù)合法局部灌腸法建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。

1.4.2 分組:將雌性大鼠隨機(jī)分為:正常組、模型組、MSCs組，每組10只。模型組和MSCs組建立大鼠UC模型。24 h后，正常組和模型組經(jīng)尾靜脈注入0.9% 氯化鈉溶液1 mL;MSCs組經(jīng)尾靜脈注入1×106MSC s 懸液1 mL。

1.4.3 取材:建立模型后，觀察大鼠日?；顒?dòng)、進(jìn)食以及腹瀉和黏液膿血便情況。2周后，留取每只大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織長(zhǎng)約8 cm，比較各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。取病變明顯的結(jié)腸組織標(biāo)本。

1.5 熒光原位雜交結(jié)合免疫熒光染色

1.5.1 Y染色體DNA 熒光原位雜:交采用熒光原位雜交(SRY FISH)及DAPI 復(fù)染技術(shù)檢測(cè)，按照大鼠SRY FISH 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作以及按DAPI 說(shuō)明書(shū)步驟染色。

1.5.2 免疫熒光染色檢測(cè)CK20表達(dá):結(jié)腸組織連續(xù)切片、拷片、脫蠟復(fù)水;抗原修復(fù)后，孵育，封閉，滴加兔抗大鼠CK20 單克隆抗體，4℃過(guò)夜;滴加生物素化羊抗大鼠抗體，孵育;加SABC-CY3，封片;滴加DAPI 避光孵育，核復(fù)染;用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。

1.5.3 采集熒光圖像:各組結(jié)腸組織切片按以上步驟處理后，在熒光顯微鏡下，F(xiàn)AM 激發(fā)波長(zhǎng)λ=510 nm，觀察采集位于細(xì)胞核內(nèi)的黃綠色熒光圖像。DAPI 激發(fā)波長(zhǎng)λ= 360 nm，觀察采集細(xì)胞核內(nèi)的藍(lán)色熒光圖像。CY 3 激發(fā)波長(zhǎng)λ = 550 nm，觀察采集位于細(xì)胞質(zhì)的紅色熒光。應(yīng)用Imagepro3Dss.1 圖像處理軟件進(jìn)行圖片掃描、取圖、圖像疊加。

1.6 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)CK20、NF-κB、IL-4的表達(dá)

按照TRIzol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取結(jié)腸組織細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，引物序列如下:β-actin 正向:5'-CACGATGGA GGGGCCGGACTCATC-3'，β-actin 反向:5'-TAAAG ACCTCTATGCCAACACAGT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度240 bp;Rat CK20 正向:5'-ATGCGGATAACTGTGGAAGC-3'，Rat CK20 反 向:5'-CCTCCACGTTGACATTGTTG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度187 bp;Rat NF-κB 正向:5'-CCGTGAGGC TGTTTGGTTTG-3'，Rat NF-κB 反 向:5'-GGTCTGCC CTCCTGACTCTA-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度92 bp;Rat IL-4 正向:5'-GTACCAGACGTCCTTACGGC-3'，Rat IL-4 反向:5'-CTCAGTTCACCGAGAACCCC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度143 bp;反應(yīng)條件為:94℃4 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃25 s;30個(gè)循環(huán)，72℃4 min，4℃4 min。采用2－△△Ct方法分析各組相對(duì)基因表達(dá)差異。

1.7 Westen blot檢測(cè)NF-κB蛋白的表達(dá)

?。?0℃低溫保存的結(jié)腸組織，測(cè)定蛋白濃度，制成含蛋白量相等的樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜;TBS 洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗室溫孵育2 h，ECL 顯色劑顯色，用Bio Rad 密度掃描儀進(jìn)行掃描，測(cè)定各蛋白的相對(duì)吸光度值。

1.8 ELISA 檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-4 含量

將組織樣品稱(chēng)重，按組織質(zhì)量∶PBS 體積=1∶9的比例用預(yù)冷的PBS 將組織樣品勻漿，4℃10 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清檢測(cè)。ELISA 實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀測(cè)A值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 MSC 形態(tài)學(xué)特征及鑒定

接種24 h后可見(jiàn)散在分布的貼壁細(xì)胞，為短梭形、橢圓形、長(zhǎng)梭形;15 d后，細(xì)胞的體積增大，呈旋渦狀排列。經(jīng)消化、傳代后，第3代MSCs 在24 h 內(nèi)即可完全貼壁、伸展，呈紡錘狀形態(tài)。第3代MSCs表達(dá)CD29 和CD90，不表達(dá)CD45 和CD11b，可判定最終培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs(圖1，2)。

2.2 造模臨床觀察

模型組和MSCs組大鼠大部分出現(xiàn)豎毛、活動(dòng)減少、飲食減少，并出現(xiàn)稀便和黏液膿血便，說(shuō)明UC造模成功。

圖1 第3代MSCsFig1 The MSCs of passage 3(×200)

圖2 F3代MSCs 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig2 Flow cytometry analysis of passage 3 MSCs

2.3 組織病理觀察

模型組大鼠結(jié)腸有明顯的充血水腫，黏膜結(jié)構(gòu)異常，伴壞死和糜爛，部分黏膜上皮損傷脫落，杯狀細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞侵襲全層;MSCs組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)尚完整，上皮輕度損傷，杯狀細(xì)胞增多，充血水腫較輕，潰瘍較淺表，炎性細(xì)胞侵襲減少(圖3)。

2.4 Y染色體和CK20 雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

結(jié)腸組織切片可見(jiàn)位于細(xì)胞質(zhì)的紅色熒光，即CK20 陽(yáng)性，主要分布于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞;MSCs組結(jié)腸組織切片可藍(lán)色熒光的細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光亮點(diǎn)，即Y染色體SRY FISH 陽(yáng)性表達(dá)，在結(jié)腸組織腸黏膜上皮和固有層均有分布。部分Y染色體陽(yáng)性細(xì)胞，可見(jiàn)位于細(xì)胞質(zhì)的紅色熒光，即Y染色體和CK20 雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(圖4)。

2.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

模型組及MSCs組CK20表達(dá)較正常組增高P＜0.01)，MSCs組表達(dá)高于模型組(P＜0.01)，模型組和MSCs組NF-κB表達(dá)高于正常組，IL-4表達(dá)低于正常組(P＜0.01);MSCs組NF-κB表達(dá)低于模型組，IL-4表達(dá)高于模型組(P＜0.01)(表1)。

圖3 各組大鼠病變結(jié)腸組織病理觀察Fig3 Pathologic changes of the colonic tissues of rats in respective experimental group(×100)

圖4 SRY FISH 和CK20 免疫熒光染色Fig4 Fluorescent Y chromosome in situ hybridization and immunofluorescent staining of CK20(×400)

表1 各組CK20、NF-κB、IL-4 mRNA 相對(duì)表達(dá)結(jié)果Table1 The mRNA expression of CK20，NF-κB and IL-4 in different groups (±s，n=10)

表1 各組CK20、NF-κB、IL-4 mRNA 相對(duì)表達(dá)結(jié)果Table1 The mRNA expression of CK20，NF-κB and IL-4 in different groups (±s，n=10)

*P＜0.01 compared with normal control group;#P＜0.01 compared with model group.

group CK20 NF-κB IL-4 normal control 1.060±0.193 0.981±0.130 1.03 5±0.104 model 1.758±0.320* 3.546±0.593* 0.178±0.038*MSCs 2.564±0.429# 1.758±0.221# 0.518±0.029#

2.6 Westen blot檢測(cè)結(jié)果

模型組NF-κB表達(dá)顯著高于正常組(P＜0.01)，MSCs 干預(yù)組NF-κB表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，但仍高于正常組(P＜0.01)(圖5)。

2.7 ELISA 檢測(cè)結(jié)果

模型組及MSCs組IL-4的水平較正常組顯著減低(P＜0.01)，而MSCs組中IL-4的水平比模型組升高(P＜0.01)(圖6)。

圖5 Western blot檢測(cè)NF-κB蛋白的表達(dá)Fig5 The expression of NF-κB proteins detected by Western blot(±s，n=10)

圖6 ELISA 檢測(cè)IL-4的表達(dá)Fig6 The expression of IL-4 detected by ELISA(±s，n=10)

3 討論

結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞是維持腸道功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，UC 常常伴結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡加速[4]，且由于腸道內(nèi)產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)，加劇損傷腸黏膜屏障功能[5]。因此抑制腸道炎性反應(yīng)、修復(fù)上皮細(xì)胞從而改善腸上皮屏障功能是治療UC的新思路。

MSCs 有提高受損上皮再生的能力，可能是上皮細(xì)胞再生的來(lái)源[6]。有研究證明MSCs 能通過(guò)分化為上皮細(xì)胞促進(jìn)損傷氣道黏膜的修復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到雌性大鼠結(jié)腸組織中出現(xiàn)帶Y染色體標(biāo)志的雄性供體來(lái)源的細(xì)胞，主要分布在結(jié)腸黏膜上皮及固有層。同時(shí)檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞表型特征標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白20(CK20)，CK20表達(dá)范圍特異，能在胃腸道組織的上皮細(xì)胞中表達(dá)，可作為檢測(cè)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的特征性指標(biāo)。證明結(jié)腸組織部分上皮細(xì)胞是雄性供體來(lái)源的MSCs 分化而成的新生上皮細(xì)胞。

免疫異常是UC 發(fā)病的重要因素[8]。MSCs 具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，可以抑制T細(xì)胞、B 細(xì)胞增殖、影響樹(shù)突細(xì)胞的成熟及功能[9]。NF-κB 和IL-4與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究表明，MSCs 能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 和IL-4的表達(dá)，改善腸道的炎性反應(yīng)狀態(tài)，另外通過(guò)分化為結(jié)腸組織上皮細(xì)胞，促進(jìn)黏膜上皮的修復(fù)。

[1]王志紅，郭坤元，鄧蘭，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植減輕衰老大鼠腸損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:1026-1031.

[2]文通，魏云峰，王夢(mèng)洪，等.microRNA-1 誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:41-46.

[3]孫昭，韓欽，趙春華.骨髓和脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的比較[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32:128-132.

[4]Scarpa M，Castagliuolo I，Castoro C，et al.Inflammatory colonic carcinogenesis:a review on pathogenesis and immunosurveillance mechanisms in ulcerative colitis[J].World J Gastroenterol，2014，20:6774-6785.

[5]Boldeanu MV，Silosi I，Ghilusi M，et al.Investigation of inflammatory activity in ulcerative colitis[J].Rom J Morphol Embryol，2014，55:1345-1351.

[6]Li K，Han Q，Yan X，et al.Not a process of simple vicariousness，the differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells to renal tubular epithelial cells plays an important role in acute kidney injury repairing[J].Stem Cells Dev，2010，19:1267-1275.

[7]Kokubun K，Pankajakshan D，Kim MJ，et al.Differentiation of porcine mesenchymal stem cells into epithelial cells as a potential therapeutic application to facilitate epithelial regeneration[J].J Tissue Eng Regen Med，2013，doi:10.1002/term.1758.

[8]Maul J，Zeitz M.Ulcerative colitis:immune function，tissue fibrosis and current therapeutic considerations[J].Langenbecks Arch Surg，2012，397:1-10.

[9]Yi T，Song SU.Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells and their therapeutic applications[J].Arch Pharm Res，2012，35:213-221.