人胰島素抑制大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A凋亡且促增殖

王改平，陳莎莎，李曉芳，楊 婧，趙衛(wèi)明，常翠芳，徐存拴

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;2.河南省-科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng)453007)

胰島素是一種多功能的蛋白質(zhì)激素，具有刺激DNA 和蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素能有效地促進(jìn)脂肪細(xì)胞3T3-F442A的生成[1]。此外，胰島素還可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人膀胱癌細(xì)胞系(T24)和原代大鼠卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖[2-3]。原代肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)存在生長(zhǎng)條件苛刻、增殖和傳代困難等缺點(diǎn)[4]，一定程度上限制了其在肝臟功能研究上的應(yīng)用。研究者嘗試加入胰島素、地塞米松等生長(zhǎng)因子以促進(jìn)原代肝細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)[5]。BRL-3A是來自大鼠肝臟的肝細(xì)胞系，并在肝細(xì)胞研究中被廣泛用作正常肝細(xì)胞[6]，目前還沒有關(guān)于人胰島素對(duì)BRL-3A的體外作用研究。因此，本研究將不同濃度的人胰島素作用于BRL-3A細(xì)胞，并通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)和qRT-PCR 等方法檢測(cè)人胰島素對(duì)肝細(xì)胞系的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠BRL-3A 肝細(xì)胞系(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);DMEM 培養(yǎng)基、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和Trizol(Invitrogen 公司);胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司);諾和靈R 人胰島素(丹麥諾和諾德公司);MTT 和二甲基亞砜(Geneview 公司);DNase Ⅰ和AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司);qPCR引物(由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 BRL-3A細(xì)胞的培養(yǎng):BRL-3A細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基(含青霉素100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL)中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 比色法檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞活性:取第3代BRL-3A細(xì)胞接種于96孔板(3 000個(gè)細(xì)胞/孔，0.2 mL 培養(yǎng)基)，給予諾和靈R 人胰島素(human insulin，HI)梯度處理，終質(zhì)量濃度分別為0、10、100、500 和1 000 nmol/L，每個(gè)梯度設(shè)置3 孔重復(fù)，孵育12 h后，加入10 μL MTT，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉上清，每孔加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩混勻10 min，使其充分溶解由活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚晶體，于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各孔吸光度A值。按上述操作檢測(cè)胰島素作用第1、2、3、4 和5 天的細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析:取對(duì)數(shù)期增殖BRL-3A細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞調(diào)整為2×104個(gè)/孔，給予500 nmol/L人胰島素處理，同時(shí)設(shè)置未處理對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)孔，并作3次重復(fù)，24 h后換液，處理3 d后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗1次(1 000 r/min，4℃，10 min)，棄上清，于70%乙醇中－20℃固定過夜，然后，將樣品離心(3 000 r/min，10 min，室溫)，棄上清，沉淀用500 μL 預(yù)冷PBS 洗1次(3 000 r/min，10 min，室溫)，棄上清，再用含0.1 mg/mL RNase A的PI 染色液(50 mg/L)重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15 min，300 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，最后，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布情況。

用500 nmol/L人胰島素處理3 天后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中離心(1 000 r/min，4℃，10 min)，用PBS 洗2次。每個(gè)樣品中加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL 染液FITC，室溫避光孵育15 min，然后補(bǔ)加300 μL 結(jié)合緩沖液，加入10 μL 染液PI，室溫避光孵育5 min，300 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，最后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)CCNA2、BAX、JUN 和MYC 基因的表達(dá):根據(jù)GenBank 上大鼠CCNA2 (NM_053702)，BAX(NM_017059)，JUN(NM_021835.3)和MYC(NM_012603.2 )的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)其qPCR引物。引物序列如下:CCNA2上游5'-CTTTTAGTGCCGCTGTCTCTTT-3'，下游5'-GCCCGCATACTGTTAGTGATGT-3';BAX 上游5'-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3'，下游5'-CAAAG TAGAAGAGGGCAACCAC-3';JUN 上游5'-GGCTGT TCATCTGTTTGTCTTCAT-3'，下 游5'-CCCTTTTCTT TACGGTCTCGGT-3';MYC 上游5'-CCCTACCCGCTC AACGACA-3'，下游5'-GCCTCTTTTCCACAGACACC A-3';按Trizol的操作說明分離、純化BRL-3A細(xì)胞的總RNA。反轉(zhuǎn)錄前用DNaseⅠ37℃消化總RNA 30 min，以去除殘留的基因組DNA 污染。用上述純化的BRL-3A細(xì)胞RNA 為模板，按照AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA 第一鏈。然后采用SYBR Green Ⅰ摻入的方法在Rotor Gene 3000(Corbett Robotics，CA)對(duì)基因CCNA2、BAX、JUN 和MYC 以及內(nèi)參基因ACTB 分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而計(jì)算出靶基因在胰島素處理后的相對(duì)含量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響

100nmol/L人胰島素作用于BRL-3A細(xì)胞第4天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組吸光度值開始高于對(duì)照組;當(dāng)人胰島素濃度為500 nmol/L，藥物消耗量適中，且從第3 天開始，實(shí)驗(yàn)組吸光度值即顯著高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01);而1 000 nmol/L人胰島素處理后第1天，實(shí)驗(yàn)組吸光度值即極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)(表1)，但因藥物消耗量太大，本文選擇500 nmol/L的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 人胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞周期的影響

500nmol/L人胰島素處理BRL-3A細(xì)胞3 d后，處于G0/G1期的細(xì)胞比例為64.16%±1.73%，顯著低于對(duì)照組的68.16%±1.36%(P＜0.05)，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例經(jīng)過處理后開始增多(圖1)。

2.3 人胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響

用500nmol/L人胰島素處理BRL-3A細(xì)胞3 d后，實(shí)驗(yàn)組的凋亡率為2.17%±0.36 %，對(duì)照組為2.97%±0.20%，處于早、晚期凋亡的細(xì)胞比例比對(duì)照顯著降低(P＜0.05)(圖2)。

2.4 人胰島素對(duì)目的基因表達(dá)的影響

經(jīng)500nmol/L人胰島素作用后JUN 和MYC 無(wú)顯著表達(dá)變化，BAX表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，而CCNA2表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)(圖3)。

表1 MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度人胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響Table1 Influence of human insulin on the proliferation of BRL-3A detected by MTT method(±s，n=3)

表1 MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度人胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響Table1 Influence of human insulin on the proliferation of BRL-3A detected by MTT method(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control.

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圖1 500 nmol/L人胰島素(HI)處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞周期的影響Fig1 Impact of 500 nmol/L human insulin on cell cycle progression in BRL-3A

圖2 500 nmol/L人胰島素(HI)處理對(duì)BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響Fig2 Effect of 500 nmol/L human insulin on the apoptosis of BRL-3A cells

圖3 qRT-PCR檢測(cè)人胰島素處理后4個(gè)目的基因的表達(dá)變化Fig3 Expression changes of four target genes after human insulin treatment were detected by qRT-PCR(±s，n=3)

3 討論

通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胰島素可能通過激活大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(SMCs)的MAPK 通路中的ERK 途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡[8]。研究胰島素對(duì)大鼠卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，它能誘導(dǎo)該原代細(xì)胞增殖，并促進(jìn)CDK4，CCND3 和PCNA 等蛋白的表達(dá)，而用mTOR 抑制劑-雷帕霉素處理后，參與細(xì)胞周期G1/S 轉(zhuǎn)換的CCND1 和CCND3 等基因的mRNA表達(dá)受到抑制[3]。本研究選擇500 nmol/L的人胰島素處理BRL-3A細(xì)胞3 d后發(fā)現(xiàn)，處于G0/G1期的細(xì)胞比例與對(duì)照相比顯著降低。通過qRT-PCR 方法繼續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CCNA2基因與對(duì)照相比明顯上調(diào)，卻沒有發(fā)現(xiàn)CCND1 和CCND3 基因的表達(dá)上調(diào)。CCNA2是編碼細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)的基因，CCNA2 可以在S期結(jié)合CDK2，在G2/M期結(jié)合CDK1，因此CCNA2 對(duì)S期和G2/M期的運(yùn)轉(zhuǎn)至關(guān)重要。CCNA2 基因過表達(dá)可以促進(jìn)耳蝸神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖[9]。用RNAi 技術(shù)敲除人宮頸癌HeLa 細(xì)胞的CCNA2 基因后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核被膜裂解明顯延遲，細(xì)胞增殖受抑制[10]。以上結(jié)果表明，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與流式結(jié)果具有一致性，CCNA2 可能在人胰島素處理后參與促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，降低G0/G1期細(xì)胞的比例，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是指在特定時(shí)空發(fā)生的、受機(jī)體嚴(yán)密調(diào)控的細(xì)胞自殺現(xiàn)象，是一種基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程。BAX是與凋亡密切相關(guān)的基因，當(dāng)BAX 過量時(shí)，形成BAX 同源二聚體，細(xì)胞則趨向凋亡[11]。研究表明，戊地昔布可通過增高BAX表達(dá)誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的凋亡[12]。此外，胰島素能通過抑制BAX 基因的表達(dá)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)C6細(xì)胞凋亡[13]。與上述研究結(jié)果一致，本文的qRTPCR檢測(cè)結(jié)果表明，BAX 基因在500 nmol/L人胰島素處理后的BRL-3A細(xì)胞中明顯下調(diào)，只有對(duì)照的57.43%。因此，大鼠BRL-3A細(xì)胞的增殖可能與BAX 基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。

總之，人胰島素對(duì)大鼠肝細(xì)胞BRL-3A 有促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用，并伴隨著CCNA2 基因的表達(dá)上調(diào)和BAX 基因的表達(dá)下調(diào)。由此推斷，抑制凋亡發(fā)生和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖可能是胰島素促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞增殖的重要機(jī)制，然而細(xì)胞增殖是非常復(fù)雜的過程，涉及的信號(hào)通路和具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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