STAT3異常激活對人臍帶間充質(zhì)干細胞在乳腺癌微環(huán)境中惡性轉(zhuǎn)化的影響

汪 玲，朱 靜*，田 杰，2，譚 彬，燕 莎

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院1.兒童發(fā)育與疾病研究教育部重點實驗室 兒科學(xué)重慶市重點實驗室;2.心血管內(nèi)科，重慶400014)

近年來惡性腫瘤的治療已成為臨床醫(yī)學(xué)研究關(guān)注的熱點。據(jù)報道，間充質(zhì)干細胞作為載體靶向治療腫瘤開展了大量實驗研究并取得了較好的成果，多項實驗已進入臨床試驗階段[1-2]。已有研究提示，MSCs 在長期體外培養(yǎng)條件下存在惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險[3]，但并無針對特定環(huán)境中干細胞是否發(fā)生生物學(xué)特性變化，從而引發(fā)潛在的安全應(yīng)用風(fēng)險的相關(guān)報道。本研究將探尋在MCF-7B 乳腺癌微環(huán)境中人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是否存在惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險，以及該惡變與STAT3異常激活的關(guān)系，從而為hUCMSCs的臨床安全應(yīng)用奠定科學(xué)的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 公司);胰蛋白酶(Sigma 公司);STAT3、c-Myc、Bcl-xL 和GAPDH 引物(上海生工);全蛋白提取試劑盒(凱基生物);抗體:STAT3、p-STAT3、c-Myc 和Bcl-xL(Abcam公司);β-actin(中杉金橋);人臍帶間充質(zhì)干細胞hUCMSCs(重慶市干細胞庫惠贈);人乳腺癌細胞系MCF-7B(廣州吉妮歐生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基于37℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)hUCMSCs 及MCF-7B 細胞，待貼壁增殖至匯合度約90%經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2 傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組:本研究共設(shè)為3 組，空白對照組:10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)hUMSCs 2 周;實驗組:MCF-7B 乳腺癌細胞2次培養(yǎng)液與10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基以1∶1 比例培養(yǎng)hUCMSCs 2 周;陽性對照組:10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7B 2 周細胞。

1.2.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微鏡觀察各組細胞增殖狀態(tài)，拍照記錄。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期:胰蛋白酶消化并收集1×106個細胞，PBS 清洗兩遍后棄上清，70%乙醇1 mL 內(nèi)固定，4℃過夜，RNase 消化，PI 染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 RT-qPCR檢測各組細胞STAT3、c-Myc 和Bcl-xL的mRNA的表達:根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書步驟提取各組細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板進行PCR擴增。目的基因的引物序列如下，以GAPDH 為內(nèi)參，將空白對照組的mRNA表達量設(shè)為1，以2－△△ct計算各組mRNA的相對表達量(表1)。

1.2.6 細胞免疫熒光檢測p-STAT3、c-Myc 和BclxL蛋白表達及定位:4%多聚甲醛固定15 min，1%Triton-X 通透10 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加一抗4℃孵育過夜，根據(jù)一抗來源加對應(yīng)二抗37℃孵育1 h，DAPI 染核10 min;封片，熒光顯微鏡觀察。觀察10個視野，細胞陽性表達率為陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.2.7 Western blot檢測p-STAT3、STAT3、c-Myc 和Bcl-xL蛋白表達:按照蛋白提取試劑盒說明提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后加入SDS 上樣緩沖液，煮沸使其充分變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，加一抗4℃搖床孵育過夜，PBST 洗膜后根據(jù)一抗來源加對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，PBST 洗膜后于凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩個樣本均數(shù)之間的比較采用獨立樣本t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài)學(xué)特征

對照組hUCMSCs 細胞呈扁平長梭形，排列有序，漩渦狀生長。實驗組hUCMSCs 經(jīng)2 周共培養(yǎng)后細胞呈多形性，大小不均，核質(zhì)比增大，細胞聚集成團狀生長，排列紊亂。MCF-7B 細胞貼壁性強，呈多邊形，核質(zhì)比大，細胞成團生長，排列不規(guī)則(圖1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table1 RT-qPCR primer sequence of target gene

2.2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期

實驗組細胞G1期比例顯著低于對照組(P＜0.05)，S期和G2期均顯著高于對照組(P＜0.05)(表2)。

2.3 RT-qPCR檢測各組細胞STAT3、c-Myc 和Bcl-xLmRNA的表達

實驗組細胞STAT3、c-Myc 和Bcl-xLmRNA的表達量均顯著高于空白對照組(P＜0.05)(圖2)。

2.4 細胞免疫熒光檢測p-STAT3、c-Myc 和BclxL蛋白表達及定位

p-STAT3表達定位于細胞核，實驗組細胞核內(nèi)表達陽性率為82%，空白對照組核內(nèi)沒有表達;c-Myc表達定位于細胞核，實驗組細胞核內(nèi)表達陽性率為88%，顯著高于空白對照組的11% (P＜0.05);Bcl-xL 胞質(zhì)與胞核均有表達，但主要定位于細胞核外膜，實驗組細胞表達陽性率為78%顯著高于空白對照組的15%(P＜0.05)(圖3)。

圖1 各組細胞形態(tài)Fig1 Morphology of cells detected by invertedmicroscope(×100)

表2 各組細胞周期時相布Table2 The cell cycle distribution analysised by FCM

2.5 Western blot檢測p-STAT3、STAT3、c-Myc和Bcl-xL蛋白表達

實驗組細胞p-STAT3、STAT3、c-Myc 和Bcl-xL蛋白表達量均顯著高于空白對照組(P＜0.05)(圖4)。

圖2 各組細胞STAT3、c-Myc 和Bcl-xL的mRNA的表達Fig2 The mRNA expressions of STAT3，c-Myc and Bcl-xL by RT-qPCR

圖3 免疫熒光檢測p-STAT3、c-Myc 和Bcl-xL蛋白表達及定位Fig3 The protein expression and location of p-STAT3，c-Myc and Bcl-xL(scale bar=100 μm)

圖4 Western blot檢測p-STAT3、STAT3、c-Myc 和Bcl-xL蛋白表達Fig4 The protein expressions of p-STAT3，STAT3，c-Myc and Bcl-xL by Western blot

3 討論

間充質(zhì)干細胞具有低免疫原性和腫瘤趨化性，通過細胞工程學(xué)改造使其成為各種抗癌成分的載體，可靶向釋放細胞因子、溶瘤病毒和轉(zhuǎn)化藥物等治療腫瘤[4]。據(jù)報道，攜帶IL-12 基因的干細胞不但能夠有效地抑制黑色素瘤、乳腺癌和肝癌等腫瘤細胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，還能夠明顯的增加腫瘤細胞的凋亡[5]。然而國內(nèi)外均有間充質(zhì)干細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的報道，提示特定的干細胞生存微環(huán)境與其惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，但具體機制不明[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與C6 膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)后檢測到突變型P53、Cyclin D1 和BclxL 等相關(guān)癌基因的表達增高，并可在裸鼠皮下形成腫瘤[8]。

間充質(zhì)干細胞來源豐富，hUCMSCs 因來源方便、無倫理學(xué)問題、不損害供者生命健康，具有良好增殖能力的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于臨床干細胞治療。hUCMSCs 在靶向治療過程中暴露于腫瘤微環(huán)境，在腫瘤細胞及其分泌的各種活性因子的作用下是否會出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)變，成為臨床安全應(yīng)用hUCMSCs的關(guān)鍵性問題。

腫瘤形成過程中廣泛存在信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的異常激活，STAT3 處于多條致癌信號通路的交匯點，被認為是一種原癌基因[9]。腫瘤微環(huán)境中高分泌的多種細胞因子、生長因子(IL-6、IL-8、TNF-α 和VEGF 等)[10]均可使STAT3 磷酸化激活后入核調(diào)控相關(guān)靶基因，通過其下游調(diào)控基因c-Myc和Bcl-xL的表達參與腫瘤形成[11]。本研究從STAT3異常激活的角度探討STAT3 與hUCMSCs 惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系。

本實驗結(jié)果顯示，與MCF-7B 間接共培養(yǎng)2周后的hUMSCs 排列紊亂，成團聚集生長，黏附性差，折光性增強。細胞周期檢測結(jié)果表明與腫瘤細胞共培養(yǎng)促進干細胞通過G1-S期這一最重要的周期檢測點，其主要受細胞外信號的調(diào)控，而失去限制點調(diào)控的細胞傾向于在細胞周期中持續(xù)循環(huán)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。細胞中STAT3 和p-STAT3表達明顯增高，且免疫熒光顯示p-STAT3的表達主要定位于細胞核內(nèi)，表明經(jīng)乳腺癌細胞2次培養(yǎng)液誘導(dǎo)后的干細胞STAT3 高表達并高度激活，磷酸化進入細胞核內(nèi)對下游基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控。其下游靶基因c-Myc 高表達于惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，是參與調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡的原癌基因，在細胞周期調(diào)控中起重要作用。c-Myc 蛋白高表達與乳腺癌的侵襲、血管生成和預(yù)后密切相關(guān)[12]。Bcl-xL是Bcl-2 家族的重要成員，在阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命中發(fā)揮重要作用，而凋亡不足正是許多腫瘤發(fā)生的重要機制[13]。本實驗在基因及蛋白水平證實了下游c-Myc和Bcl-xL的顯著高表達，這與上述文獻報道中腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)過程是一致的，表明hUCMSCs 受到MCF-7B 乳腺癌細胞微環(huán)境中多種細胞因子、生長因子的持續(xù)作用，引發(fā)STAT3異常磷酸化激活后與靶基因結(jié)合，啟動下游c-Myc 和Bcl-xL 等腫瘤相關(guān)靶基因表達，致使hUCMSCs 出現(xiàn)增殖失控、凋亡不足、細胞周期紊亂的惡性轉(zhuǎn)化趨勢。

綜上所述，hUCMSCs 在乳腺癌微環(huán)境中存在惡性轉(zhuǎn)化傾向，且STAT3的異常激活是導(dǎo)致hUCMSCs惡性轉(zhuǎn)變的重要因素之一，然而腫瘤信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控極其復(fù)雜，STAT3 也受到了上游信號分子的多重調(diào)控，因此有必要構(gòu)建STAT3 過表達及干擾模型來進一步驗證STAT3異常激活在hUCMSCs 惡性轉(zhuǎn)化中的作用機制。

[1]Seo SH，Kim KS，Park SH，et al.The effects of mesenchymal stem cells injected via different routes on modified IL-12-mediated antitumor activity[J].Gene Ther，2011，18:488-495.

[2]Shah K.Mesenchymal stem cells engineered for cancer[J].Adv Rev，2012，64:739-748.

[3]Rosland GV，Svendsen A，Torsvik A，et al.Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation[J].Cancer Res，2009，69:5331-5339.

[4]Yang ZS，Tang XJ，Guo XR，et al.Cancer cell-oriented migration of mesenchymal stem cells engineered with an anticancer gene (PTEN):an imaging demonstration[J].Onco Targets Ther，2014，7:441-446.

[5]Chen X，Lin X，Zhao J，et al.A tumor-selective biotherapy with prolonged impact on established metastases based on cytokine gene-engineered MSCs[J].Mol Ther，2008，16:749-756.

[6]Rubio D，Garcia S，Paz MF，et al.Molecular characterization of spontaneous mesenchymal stem cell transformation[J].PLoS ONE，2008，doi:10.1371/journal.pone.0001298.t004.

[7]Pan Q，F(xiàn)ouraschen SMG，de Ruiter PE，et al.Detection of spontaneous tumorigenic transformation during culture expansion of human mesenchymal stromal cells[J].Exp Biol Med，2014，239:105-115.

[8]張亞蘭，周娜，張曉萍.腫瘤微環(huán)境中間充質(zhì)干細胞的相關(guān)生物學(xué)特性分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35:67-70.

[9]Johnston PA，Grandis JR.STAT3 signaling:anticancer strategies and challenges[J].Mol Interv，2011，11:18-26.

[10]Troester MA，Lee MH，Carter M，et al.Activation of host wound responses in breast cancer microenvironment[J].Clin Cancer Res，2009，15:7020-7028.

[11]Lai SY，Johnson FM.Defining the role of the JAK-STAT pathway in head and neck and thoracic malignancies:implications for future therapeutic approaches[J].Drug Resist Updat，2010，13:67-78.

[12]Gabay M，Li Y，F(xiàn)elsher DW.MYC activation is a hallmark of cancer initiation and maintenance[J].Cold Spring Harb Perspect Med，2014，4:46-54.

[13]Tischner D，Woess C，Ottina E，et al.Bcl-2-regulated cell death signalling in the prevention of autoimmunity[J].Cell Death Dis，2010，1:e48.doi:10.1038/cddis.2010.27.