YC-1對低氧誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和P53表達(dá)的影響

李明星，蔣德旗，2，王 艷，馬艷姣，喻珊珊*，王 勇*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 藥劑科，廣東 廣州510282;2.玉林師范學(xué)院 生物制藥教研室，廣西 玉林537000)

低氧性肺動脈高壓(hypoxia pulmonary hypertension，HPH)是由低氧性肺動脈收縮和低氧性肺血管重構(gòu)引起的肺動脈壓持續(xù)升高的不可逆性疾病[1]。肺血管重構(gòu)是HPH 形成的重要標(biāo)志，其組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為中膜平滑肌層的過度增生和肥大，中膜的增厚主要由于肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的聚集所致。目前研究已證實(shí)低氧能夠上調(diào)HIF-1α (hypoxia-inducible factor-1 alpha)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游與增殖相關(guān)的靶蛋白，促進(jìn)PASMCs的增殖[2]。YC-1{3-(5-hydroxymethl-2-furyl)-1-benzylind-azole}是HIF-1α 特異性抑制劑，已被證實(shí)其具有優(yōu)越的保護(hù)血管平滑肌受損的活性，并具有劑量依從性。本研究擬在探究YC-1對低氧誘導(dǎo)人HPASMCs增殖、凋亡以及P53表達(dá)的影響，并探討其相關(guān)分子機(jī)制，為HPH的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺動脈平滑肌細(xì)胞(Life 公司);DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco 公司);低氧氣體(3% O2、5% CO2、92% N2)(佛山德力梅塞爾氣體有限公司);CCK-8 試劑盒、AnnexinV/FITC凋亡檢測試劑盒(Dojindo 公司);YC-1(Cayman 公司);BCA蛋白測定試劑盒和ECL 顯色試劑盒(Thermo 公司);HIF-1α 兔多克隆抗體(Abclonal公司);P53 兔多克隆抗體(萬類生物科技公司);GAPDH 兔多克隆抗體(CST 公司);RIPA 裂解液和山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HPASMCs 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中。常氧組培養(yǎng)于含有5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中;低氧培養(yǎng):3% O2、5%CO2、92% N2;培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8 法檢測YC-1對HPASMCs增殖率的影響:取對數(shù)增殖期HPASMCs 制成細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔5×103個，加入含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h，換無FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h(以去除血清對細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的YC-1 并置低氧環(huán)境中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對照組、低氧組及低氧+YC-1(0.01 和0.05 mmol/L)組，每組設(shè)5個復(fù)孔;低氧培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm 波長下讀取吸光度A值，以常氧組A值為100%，計算處理組與常氧對照組A的比值即細(xì)胞增殖率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測YC-1對HPASMCs 凋亡的影響:將HPASMCs細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個，加入含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h，換無FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的YC-1 并置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h，按流式細(xì)胞儀檢測方法收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌兩次，1 000 r/min 離心5 min，Annexin V 和碘化丙啶(PI)雙染15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測HIF-1α 和P53 蛋白的表達(dá):將HPASMCs 接種于60 mm×15 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)至80%匯合時，換無FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的YC-1，低氧處理24 h后，用PBS 洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞于1.5 mL 離心管中，冰上裂解45 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取25 μg 蛋白進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，目標(biāo)分子質(zhì)量的蛋白采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗(稀釋濃度HIF-1α 1∶1 000、P53 1∶1 000、GAPDH 1∶2 000)4℃孵育過夜。TBST 緩沖液室溫洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(山羊抗兔1 ∶5000)室溫孵育1 h，TBST 漂洗5min×3次。ECL 顯色，采用Image J 軟件進(jìn)行吸光度分析。

1.2.5 RT-PCR檢測P53 mRNA 水平的表達(dá):按照Trizol 試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，P53 上游引物為5'-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3'，下游引物為5'-TCATCCAAATACTCCACACGC-3'，擴(kuò)增長度125 bp;GAPDH 上游引物為5'-CGGAGTC AACGGATTTGGTCGTAT-3'，下游引物為5'-AGCCT TCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，擴(kuò)增長度210 bp。反應(yīng)體系是:95℃預(yù)變性1 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。取5 μL PCR 產(chǎn)物，加入6×上樣緩沖液，反復(fù)吸打混勻后進(jìn)行電泳，加Maker 5 μL，100 V 電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照，以P53對GAPDH的吸光度值的比值表示P53的mRNA 相對量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用One-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度YC-1對HPASMCs細(xì)胞增殖的影響

與常氧組相比，低氧組HPASMCs的增殖水平顯著增加(P＜0.05);低氧條件下，HPASMCs 經(jīng)過0.01 和0.05 mmol/L YC-1 處理24 h后，其增殖水平顯著降低(P＜0.05)(表1)。

表1 低氧和YC-1對HPASMCs增殖的影響Table1 Effect of hypoxia and YC-1 on the proliferation of HPASMCs(±s，n=5)

表1 低氧和YC-1對HPASMCs增殖的影響Table1 Effect of hypoxia and YC-1 on the proliferation of HPASMCs(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with normoxia;#P＜0.05 compared with hypoxia+0mmol/L YC-1.

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2.2 不同濃度YC-1對HPASMCs細(xì)胞凋亡的影響

與常氧組相比，低氧未加YC-1 藥物組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05);低氧條件下，YC-1(0.01和0.05 mmol/L)組細(xì)胞凋亡率顯著增加，但早期凋亡細(xì)胞數(shù)變化相對較小，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)變化明顯(P＜0.05)(圖1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HPASMCs的凋亡Fig1 Apoptosis rate of HPASMCs in each group detected by flow cytometry(n=3)

2.3 不同濃度YC-1對HPASMCs 胞內(nèi)HIF-1α、P53 蛋白表達(dá)水平的影響

低氧組HPASMCs 胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高，P53 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);低氧條件下，加入YC-1 干預(yù)后，隨著YC-1濃度的升高，HIF-1α蛋白表達(dá)顯著降低，P53 蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)(圖2)。

圖2 Western blot檢測HIF-1α、P53 蛋白表達(dá)Fig2 Expressions of HIF-1α and P53 protein by Western blot(n=3)

2.4 RT-PCR 分析不同濃度YC-1對P53 mRNA表達(dá)水平的影響

低氧組HPASMCs 胞內(nèi)P53 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);低氧條件下，加入不同濃度YC-1處理后，隨著YC-1濃度增大，P53 mRNA表達(dá)水平升高，且0.01 和0.05 mmol/L YC-1 組顯著高于0 mmol/L組(P＜0.05)(圖3)。

圖3 RT-PCR檢測不同實(shí)驗(yàn)組P53 mRNA表達(dá)Fig3 mRNA expression of P53 in different experi mental groups detected by RT-PCR(±s，n=3)

3 討論

低氧性肺動脈高壓是臨床上常見的一組嚴(yán)重慢性阻塞性肺循環(huán)疾病，具有很大的潛在危險性，可導(dǎo)致右心功能嚴(yán)重受限、衰竭甚至死亡[3]。肺動脈血管的重構(gòu)是HPH 持續(xù)發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，目前研究認(rèn)為，由肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖引起的肺血管中膜增厚是肺動脈血管重構(gòu)的主要病理改變之一[4]。低氧條件下，PASMCs的異常增殖可導(dǎo)致肺動脈血管收縮性增加、血管壁增厚、管腔狹窄，引起肺動脈壓持續(xù)升高，最終誘發(fā)肺動脈高壓[5]。因此，治療HPH的策略之一就是通過抑制PASMCs的增殖，逆轉(zhuǎn)肺動脈血管的重塑，降低肺動脈壓力。

P53是一種腫瘤抑制基因，被認(rèn)為是腫瘤中最常變化的基因，同時也是主要的細(xì)胞周期抑制因子之一，參與了細(xì)胞內(nèi)多種生理和病理過程，包括DNA的損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及血管生成等[6-7]。P53 基因分為野生型和突變型兩種，具有抑制細(xì)胞分裂和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，能抑制某些促使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的酶活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，發(fā)揮對細(xì)胞分裂與增殖的負(fù)調(diào)控作用，同時對DNA 損傷的修復(fù)起到保護(hù)作用[8]。周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是細(xì)胞分化過程中重要的分子蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。有研究證實(shí)，P53 能夠上調(diào)CDK 抑制因子P21的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖，改善肺動脈重塑[9]。

YC-1是一種化學(xué)合成吲唑化合物，能夠直接激活鳥苷酸環(huán)化酶，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型HIF-1α抑制劑，具有很好的抗血管新生及腫瘤治療活性[10]。有研究表明，在低氧誘導(dǎo)的小鼠PASMCs中，HIF-1α表達(dá)的增加，沉默野生型P53 基因，導(dǎo)致P21 下調(diào)，促進(jìn)PASMCs增殖，導(dǎo)致肺血管重塑[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低氧能夠促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，下調(diào)P53的表達(dá)，導(dǎo)致HPASMCs增殖;加入不同濃度的YC-1 處理后，HIF-1α的表達(dá)降低，P53 蛋白與mRNA表達(dá)水平增加，促進(jìn)HPASMCs的凋亡。由此推測，低氧條件下，YC-1 促進(jìn)HPASMCs的凋亡機(jī)制可能與HIF-1α的下調(diào)和P53的上調(diào)有關(guān)，但HIF-1α 與P53 之間如何相互作用以及是否通過信號通路相互作用仍未得到證實(shí)，有待于下一步深入探究。因此，研究YC-1 抗血管新生活性，有望成為治療HPH的新策略。

[1]Montani D，Price LC，Humbert M，et al.Pulmonary arterial hypertension[J].Orphanet J Rare Dis，2013，8:97-125.

[2]Li Q，Qiu Y，Mao M，et al.Antioxidant mechanism of rutin on hypoxia-induced pulmonary arterial cell proliferation[J].Molecules，2014，19:19036-19049.

[3]Fraidenburg D，Yuan J.Current and future therapeutic targets for pulmonary arterial hypertension[J].High Alt Med Biol，2013，14:134-143.

[4]劉亞，田紅燕，閆曉麗，等.貝前列素促進(jìn)野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺動脈細(xì)胞凋亡[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:955-959.

[5]Bonnet S，Neyron A，Paulin R，et al.Signal transduction in the development of pulmonary arterial hypertension[J].Pulm Circ，2013，3:278-293.

[6]Reed S，Quelle D.P53 acetylation:regulation and consequences[J].Cancers，2015，7:30-69.

[7]史晉叔，涂懷軍，張娟，等.P53對胚胎干細(xì)胞分化的影響及作用機(jī)制[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34:1264-1267.

[8]Woods SJ，Hannan KM，Pearson RB，et al.The nucleolus as a fundamental regulator of the P53 response and a new target for cancer therapy[J].Biochim Biophys Acta，2015，1849:821-829.

[9]Mizuno S，Kadowaki M，Demura Y，et al.p42/44 mitogen-activated protein kinase regulated by P53 and nitric oxide in human pulmonary arterial smooth muscle cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2004，31:184-192.

[10]Tsui L，F(xiàn)ong TH，Wang IJ.YC-1 targeting of hypoxia-inducible factor-1alpha reduces RGC-5 cell viability and inhibits cell proliferation [J].Mol Vis，2012，18:1594-1603.

[11]Mizuno S，Bogaard HJ，Kraskauskas D，et al.P53 gene deficiency promotes hypoxia-induced pulmonary hypertension and vascular remodeling in mice[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300:L753-L761.