一起鴿新城疫感染快速診斷

吳星星（新疆烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心 830063）

一起鴿新城疫感染快速診斷

吳星星（新疆烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心 830063）

為查找引起新疆某養(yǎng)鴿場(chǎng)鴿群突然發(fā)病大量死亡病原，控制疫情蔓延。通過流行病學(xué)和病理解剖觀察，然后采集病死鴿子肝臟、肺臟、喉頭和氣管等臟器組織，提取RNA，分別對(duì)其進(jìn)行禽流感熒光RT-PCR檢測(cè)和新城疫RT-PCR檢測(cè)。診斷出該鴿場(chǎng)疫情由鴿新城疫病毒感染引起。建議預(yù)防控制好鴿場(chǎng)新城疫的發(fā)生，除日常免疫接種外，全面做好鴿場(chǎng)生物安全防護(hù)及研制鴿新城疫專用疫苗更是今后的一個(gè)努力方向。

鴿新城疫；RT-PCR；熒光RT-PCR

鴿新城疫俗稱鴿瘟，是流行于鴿群中的一種高度接觸性、敗血性、急性傳染病，由新城疫病毒的一種變異株鴿I型副病毒（Pigeon Paramyx-Ovirus Type I， PPMV-1)引起[1]。該病臨床特征與雞新城疫相似，但主要以腹瀉和神經(jīng)癥狀為主[2-3]，自我國(guó)于1985年在進(jìn)口鴿中首次檢出后，全國(guó)各地均有發(fā)生，其中包括新疆[4-5]。該病一年四季以秋冬、冬春多發(fā)，不同品種、年齡的鴿子均可感染，通過塵埃、污染的器具、飼料和飲水等因素迅速傳播，發(fā)病率為80～90%以上，給養(yǎng)鴿業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前已成為養(yǎng)鴿業(yè)重點(diǎn)防控的傳染病。一般通過臨床癥狀和剖檢病變可對(duì)該病作出初步診斷，但要確診還需借助實(shí)驗(yàn)室診斷。用傳統(tǒng)方法診斷鴿I型副病毒感染需要作病原分離鑒定，其過程需經(jīng)多次雞胚傳代，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，常耽誤疫情控制的寶貴時(shí)機(jī)，給養(yǎng)鴿業(yè)造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失[6]，而近年來發(fā)展起來的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)操作方便結(jié)時(shí)、檢測(cè)特性敏感、特異可實(shí)現(xiàn)該病的快速診斷，非常適宜基層推廣使用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

新疆某養(yǎng)鴿場(chǎng)病死鴿子的肝臟、肺臟、喉頭和氣管等臟器組織。

1.1.2 設(shè)備及試劑

熒光PCR儀，梯度PCR儀均購(gòu)自美國(guó)ABI公司、組織研磨儀購(gòu)自法國(guó)Bertin公司、高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司、禽流感熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳凱杰生物技術(shù)有限公司，新城疫病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病情況及流行病學(xué)調(diào)查

該鴿場(chǎng)共飼養(yǎng)鴿子7000羽，冬季11月份經(jīng)本地引進(jìn)一批乳鴿，隨后鴿群出現(xiàn)大批量死亡，達(dá)3500羽。病鴿臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，采食減少，飲水增多，排黃綠色稀薄糞便，部分病鴿出現(xiàn)兩翅下垂、頭頸歪斜、站立不穩(wěn)或臥地不起等一系列神經(jīng)癥狀。

1.2.2 病理剖檢變化

病死鴿肛門周圍及腹部后驅(qū)羽毛粘黃綠色稀糞，胸、頸部皮下出血，腺胃乳頭出血，腸道彌漫性出血，腸系膜淋巴結(jié)出血水腫，喉頭、氣管內(nèi)有漿液物質(zhì)滲出，肺、氣管充血、出血，肝臟腫大，出血、瘀血嚴(yán)重。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室診斷

根據(jù)鴿群疫病流行特征，結(jié)合臨床癥狀及病理解剖變化，采集病變明顯的臟器組織，同時(shí)進(jìn)行禽流感與新城疫病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)。

（1）病毒總RNA的提取

將采集的病死鴿肝臟、脾臟、肺臟等組織與PBS稀釋液(pH=7.2)按1∶8比例混合，用研磨器將組織徹底研磨，放于高速冷凍離心機(jī)中，8000rpm/h，離心8min后取出，吸取離心上清液，按照商品化試劑盒操作說明，提取病毒總RNA備用。

（2）禽流感病毒熒光RT-PCR擴(kuò)增

取一滅菌離心管，根據(jù)反應(yīng)配置體系，分別加入反應(yīng)液，熒光探針、酶以及核酸，混合均勻成25ul體系，置于熒光PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)作用90min，結(jié)果判定：CT值為none的樣本為陰性。CT值≤30.0的樣本為陽(yáng)性，CT值＞30.0的樣品建議重做，重做結(jié)果CT值為none為陰性，否則為陽(yáng)性。

（3）新城疫RT-PCR擴(kuò)增

取滅菌的離心管，根據(jù)反應(yīng)配置體系，分別加入反應(yīng)液，DNA聚合酶及反轉(zhuǎn)錄酶以及核酸，混合均勻成25ul體系，置于熒光PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)作用2h，讀取的結(jié)果如圖2所示。結(jié)果判定：出現(xiàn)362bp大小條帶的樣本為陽(yáng)性，未出現(xiàn)362bp大小條帶的樣本為陰性。

1.3 結(jié)果

對(duì)4份鴿內(nèi)臟組織進(jìn)行禽流感病毒熒光RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1顯示：陽(yáng)性對(duì)照成立（CT值=22.14），并出現(xiàn)明顯的S型曲線，而4份組織樣品與陰性對(duì)照樣品一致未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，表明4份樣品均不存在禽流感感染。

圖1 禽流感熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)4份雞內(nèi)臟組織進(jìn)行新城疫RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2顯示：新城疫陽(yáng)性對(duì)照成立：出現(xiàn)362bp擴(kuò)增條帶，4份樣品與陽(yáng)性對(duì)照一致也出現(xiàn)362bp擴(kuò)增條帶，表明4份組織樣品均為新城疫病毒感染。

圖2 新城疫RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

1.4 處理措施

立即將發(fā)病鴿與健康鴿隔離、撲殺，同時(shí)徹底清除病死鴿糞便等排泄物以及污染的飼料、墊料等進(jìn)行無(wú)害化處理，對(duì)污染的器具、鴿舍墻面、地面環(huán)境等連續(xù)消毒一周，全場(chǎng)鴿群進(jìn)行新城疫疫苗緊急免疫接種，同時(shí)用多維與黃芪多糖飲水，連用7d。

2 結(jié)果與分析

通過實(shí)驗(yàn)室檢診斷，結(jié)合鴿場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)、病理解剖變化得出，該鴿場(chǎng)不存在禽流感感染，發(fā)生的疫情由鴿新城疫與鴿沙門氏菌混合感染引起。分析具體成因如下。

2.1 乳鴿母源抗體水平低

母源抗體對(duì)鴿新城疫免疫應(yīng)答具有很大影響，種鴿經(jīng)過新城疫疫苗接種后，可將其抗體通過卵黃傳遞給乳鴿，乳鴿在3日齡抗體滴度最高，以后逐漸下降，具有母源抗體的乳鴿具有一定的抵抗力，為此推測(cè)引進(jìn)乳鴿的種鴿可能未接種過新城疫疫苗或者雖然接種過疫苗，但由于免疫失敗或引進(jìn)的乳鴿其母源抗體剛好處于最低水平或消失階段，加上乳鴿自身抵抗力差，可能通過野禽和不良的飼養(yǎng)環(huán)境及方式等一系列內(nèi)外因素導(dǎo)致感染鴿新城疫毒株，再作為傳染源傳染給健康鴿群。

2.2 鴿場(chǎng)缺乏畜禽調(diào)運(yùn)檢疫知識(shí)

引進(jìn)前未向來源地索取相關(guān)疫病檢疫證明，且未做好自主性本地抽樣檢疫的疫病防范工作，其次生物安全措施不到位，將引進(jìn)的外觀健康病鴿與原有鴿群做上下樓同樓飼養(yǎng)，未進(jìn)行完全的隔離飼養(yǎng)觀察，使病原通過空氣、污染的飼料、飲水、用具、病鴿分泌物、排泄物等途徑傳播，這是導(dǎo)致疫情發(fā)生的直接原因。

3 討論

鴿新城疫感染的快速診斷是鴿病防治實(shí)踐中的一道難題。而RT-PCR技術(shù)克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的特性，以其快速、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)為有效進(jìn)行鴿新城疫的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)研究工作開展提供了快速的手段。國(guó)內(nèi)王林川等對(duì)3個(gè)中國(guó)廣東鴿新城疫病毒分離株進(jìn)行了RT-PCR目的條帶的擴(kuò)增，與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果一致；劉小銀等從疑似鴿瘟的6例臨床病例中分離到5株鴿新城疫病毒，用RT-PCR方法擴(kuò)增F蛋白裂解位點(diǎn)的基因片段，并進(jìn)行克隆、序列測(cè)定，分析表明，鴿新城疫的F蛋白的基因片段裂解位點(diǎn)處的3個(gè)序列與新城疫強(qiáng)毒在這一區(qū)域序列相符；2008年張兆敏等對(duì)成都某鴿場(chǎng)大批死亡，出現(xiàn)下痢和歪頭縮頸等明顯神經(jīng)癥狀臨及剖檢變化有全身性的黏膜和漿膜出血的病死鴿子進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定及新城疫RT-PCR檢測(cè)，確診為鴿新城疫。閻玉河等根據(jù)NDV基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及強(qiáng)、弱毒株裂解位點(diǎn)的序列差異設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了快速診斷RT-PCR技術(shù)，該方法具有快速、特異、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，不僅適用于雞胚的檢測(cè)，也適用于對(duì)病雞組織勻漿液的檢測(cè)。該技術(shù)可幫助廣大養(yǎng)鴿業(yè)者迅速準(zhǔn)確的查明病原，及時(shí)實(shí)施防疫措施控制疫情的發(fā)生蔓延，將經(jīng)濟(jì)損失降到最低[6-9]。

目前，在鴿新城疫疫病預(yù)防中，由于專用鴿新城疫疫苗還未見上市，主要使用雞新城疫疫苗進(jìn)行預(yù)防，但在實(shí)際應(yīng)用中，免疫保護(hù)效果往往不理想，免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，造成鴿場(chǎng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]。為此，在預(yù)防鴿新城疫工作中應(yīng)進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)管理，堅(jiān)持全進(jìn)全出飼養(yǎng)方式，不斷完善防疫設(shè)施設(shè)備與防疫措施，保持舍飼良好的通風(fēng)環(huán)境，定期做好日常防疫消毒工作，其次快速研究出鴿新城疫專用疫苗預(yù)防鴿新城疫也是今后發(fā)展的一個(gè)重點(diǎn)方向。

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吳星星（1986-），女，研究生，獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病預(yù)防與控制。