細(xì)針穿刺細(xì)胞塊的制作和免疫細(xì)胞化學(xué)在乳腺癌診斷和術(shù)前化療中的意義

彭芳 ，王建 ，張功亮 ，鐘斌

(1、贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000；2、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西 贛州 341000)

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)并治療乳腺癌具有很大意義。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查具有準(zhǔn)確、快速、方便和創(chuàng)傷小的特點(diǎn)，廣泛用于臨床初步判斷腫瘤的良惡性。特別在乳腺腫瘤方面，因乳腺腫瘤位置表淺，操作方便，不容易損傷血管神經(jīng)，已成為術(shù)前判斷乳腺腫瘤良惡性的主要手段[1-3]。然而細(xì)針穿刺傳統(tǒng)涂片由于涂片厚，細(xì)胞重疊，厚薄不均，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、背景不清晰，細(xì)胞量少，特別是不宜進(jìn)行ER、PR、C-erbB-2和Ki-67這些重要內(nèi)分泌標(biāo)記物的測(cè)定而有一定的局限性。本研究探索一種既操作方便又能準(zhǔn)確反應(yīng)患者內(nèi)分泌情況的方法。

我們對(duì)40例乳腺癌患者進(jìn)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，在常規(guī)涂片瑞氏染色做出細(xì)胞學(xué)診斷后剩余部分細(xì)胞制成細(xì)胞蠟塊，行HE染色及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌靶向治療相關(guān)的ER、PR、C-erbB-2和Ki-67的表達(dá)情況，并與術(shù)后組織切片免疫組化結(jié)果進(jìn)行對(duì)照研究，以此探討穿刺細(xì)胞塊的制作和免疫細(xì)胞化學(xué)在乳腺癌診斷和術(shù)前化療中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月-2015年1月，在我院有手術(shù)病理學(xué)結(jié)果并在術(shù)前做細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)并制作細(xì)胞塊的乳腺癌患者40例?；颊呔鶠榕裕挲g26~77歲，平均年齡44歲，左側(cè)病灶28例，右側(cè)病灶12例，腫物大小0.6cm~7cm。所有病例手術(shù)前均無(wú)放療、化療和激素治療病史。

1.2 細(xì)胞塊的制備 對(duì)乳腺腫塊的患者，穿刺前檢查腫物位置、大小、硬度、活動(dòng)度和邊界，碘伏消毒，左手固定腫物，右手用10ml普通注射器進(jìn)行穿刺，快速穿刺入腫物，保持5~8ml負(fù)壓，通過(guò)快速抽提8~10次，對(duì)腫物進(jìn)行反復(fù)切割，同時(shí)借助針管內(nèi)的負(fù)壓將標(biāo)本吸入穿刺針內(nèi)，涂片2張，做瑞氏染色細(xì)胞學(xué)檢查。剩余標(biāo)本直接打在玻片上并聚攏，滴2次95%的酒精覆蓋組織自然風(fēng)干，酒精和標(biāo)本中的部分血液有使其凝固和保持部分組織結(jié)構(gòu)的作用。此時(shí)組織已經(jīng)粘附在玻片上，組織和玻片直接放入10%的中性福爾馬林中固定8h后常規(guī)包埋、制片。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)方法 免疫組化試劑一抗采用福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)的ER、PR、C-erbB-2、Ki-67。檢測(cè)系統(tǒng)也采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。細(xì)胞塊石蠟切片厚度3~4μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，每次均做陽(yáng)性對(duì)照及PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 浸潤(rùn)性乳腺癌ER PR陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，若細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陰性。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞數(shù)的比例稱(chēng)為陽(yáng)性率，即在高倍鏡(400×)下借助鏡標(biāo)尺計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和腫瘤細(xì)胞數(shù)，連續(xù)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之和/腫瘤細(xì)胞數(shù)之和×100%。評(píng)分采用ASCO/CAP發(fā)表的檢測(cè)指南以1%為陽(yáng)性界值判斷腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率并參考Allred評(píng)分法，陽(yáng)性率評(píng)分如下：陰性記O分，A11red評(píng)分法將 1%~10%評(píng)為（+），11%~33%評(píng)為（++），>33%評(píng)為（+++）；染色強(qiáng)度評(píng)分如下：陰性(高倍鏡無(wú)任何細(xì)胞核染色)O分，弱(僅在高倍鏡能分辨細(xì)胞核染色)1分，中度 (低倍鏡能分辨細(xì)胞核染色)2分，強(qiáng)(低倍鏡明顯細(xì)胞核染色)3分。

HER2陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，評(píng)分采用2013年ASCO/CAP發(fā)布的最新指南：陰性：未觀察到染色或≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱或難以察覺(jué)的細(xì)胞膜染色。>10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱或難以察覺(jué)的細(xì)胞膜染色為（1+）。>10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整和(或)微弱／中度細(xì)胞膜染色或≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完整的細(xì)胞膜強(qiáng)陽(yáng)性染色為（2+）。>10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完整的細(xì)胞膜強(qiáng)染色為（3+）。

Ki-67陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，計(jì)數(shù)陽(yáng)性比例高的區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞塊HE及免疫染色結(jié)果 穿刺細(xì)胞學(xué)檢查獲取的細(xì)胞量較多，并含有微小顆粒，保留部分組織結(jié)構(gòu)，可制備高質(zhì)量的細(xì)胞塊(圖1)，有助于做出細(xì)胞病理診斷。免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示細(xì)胞分布較均勻，陽(yáng)性著色部位準(zhǔn)確，背景清晰 （圖2~圖4）。

圖1 細(xì)胞塊HE染色（×200）

圖2 細(xì)胞塊ER（×400）

圖3 細(xì)胞塊PR染色（×200）

圖 4 細(xì)胞塊HER-2（ ×400）

2.2 細(xì)胞塊與術(shù)后病理標(biāo)本免疫化學(xué)對(duì)比結(jié)果40例細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：ER陽(yáng)性28例 （陽(yáng)性率 70%）；PR陽(yáng)性 27例 （陽(yáng)性率 67.5%）；C-erbB-2陽(yáng)性：1+有4例（陽(yáng)性率 10%），2+有5例（陽(yáng)性率12.5%），3+有3例 （陽(yáng)性67.5%）；Ki67陽(yáng)性平均值35%。術(shù)后病理免疫組織化學(xué)結(jié)果為：ER陽(yáng)性30例 （陽(yáng)性率 75%）；PR陽(yáng)性 29例 （陽(yáng)性率72.5%）；C-erbB-2陽(yáng)性：1+有 5例（陽(yáng)性率 12.5%），2+有 5例 （陽(yáng)性率 12.5%），3+有 3例 （陽(yáng)性率67.5%）；Ki67陽(yáng)性平均值38%。細(xì)胞塊和術(shù)后病理標(biāo)本免疫化學(xué)結(jié)果無(wú)明顯差異，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞塊與術(shù)后病理標(biāo)本免疫化學(xué)結(jié)果

3 討論

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查在初步診斷乳腺腫塊的良惡性是一種有效手段。乳腺癌如果早期診斷，能夠選擇最有效的治療方法，而良性的腫瘤，病人可以不用再受手術(shù)治療的痛苦[1-4]。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查相對(duì)外科手術(shù)和巴德針穿刺是一種非侵襲性、痛苦小、不需要麻醉、感染機(jī)率小的診斷方法。這些標(biāo)本不僅可用于做細(xì)胞學(xué)的診斷，而且可以用于免疫細(xì)胞學(xué)檢查，給診斷和治療提供有用的信息。

隨著醫(yī)療水平和人們生活質(zhì)量的提高，乳腺癌的治療越來(lái)越規(guī)范，術(shù)前輔助化療成為重要的治療方法之一，輔助化療前要檢測(cè)ER、PR、CerbB-2、Ki67 的表達(dá)情況[2，3]，了解乳腺癌患者內(nèi)分泌情況及惡性程度和預(yù)后，才能使臨床醫(yī)生制定出合理正確的治療方案。目前診斷乳腺癌和術(shù)前檢測(cè)以上重要生物學(xué)指標(biāo)的方法有細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)涂片法、粗針穿刺和切取活檢三種方法[4-6]。細(xì)胞學(xué)涂片法有時(shí)因細(xì)胞重疊，結(jié)構(gòu)不清，固定不及時(shí)而使免疫細(xì)胞化學(xué)顯色時(shí)，背景不清晰，陽(yáng)性反應(yīng)彌散，非特異性著色，使待檢抗原在定性、定位準(zhǔn)確率方面不夠理想，并且不能連續(xù)切片及永久性保留標(biāo)本[4-10]。粗針活檢和切除活檢，操作麻煩、病人痛苦大、費(fèi)用高，有時(shí)可出現(xiàn)出血、感染等并發(fā)癥。細(xì)針穿刺吸取細(xì)胞學(xué)檢查作為乳腺腫瘤術(shù)前或新輔助化療前定性診斷的重要手段之一，具有與空心針活檢、病理檢查相類(lèi)似的作用，其診斷價(jià)值已經(jīng)得到普遍的承認(rèn)[4-7，11-15]。

我們用10ml細(xì)針穿刺乳腺癌組織，制備的細(xì)胞塊能夠彌補(bǔ)以上方法的不足之處，獲得標(biāo)本量多，通常含有微小組織或顆粒，在涂片中保留丁部分組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，更有利于做出準(zhǔn)確的細(xì)胞病理診斷，為制備高質(zhì)量的細(xì)胞塊提供了保障。并且細(xì)胞采集量多，分布適中，免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果佳，細(xì)胞塊技術(shù)最大特點(diǎn)是可以連續(xù)切片，能為乳腺癌術(shù)前輔助化療做多種抗體染色、原位雜交等以滿(mǎn)足診斷需要，并能長(zhǎng)期保留標(biāo)本。

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