高溫脅迫下受小熱休克蛋白26(sHSP26)影響的玉米葉綠體蛋白質(zhì)的研究

李娜娜，楊彥芳，趙飛云，胡秀麗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002)

農(nóng)作物在生長發(fā)育過程中常常會遭遇許多脅迫，而高溫脅迫是其遭遇的最普遍的非生物脅迫，嚴(yán)重降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量［1］。因此，提高農(nóng)作物的耐熱性，使其在脅迫環(huán)境下保產(chǎn)并增產(chǎn)迫在眉睫。植物sHSPs是核基因編碼的蛋白質(zhì)，其大小為15～43 kD的不同蛋白質(zhì)，正常條件下它參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)新生肽鏈的折疊、轉(zhuǎn)運、成熟及變性蛋白質(zhì)的降解，而在脅迫條件下主要維持蛋白質(zhì)的可溶狀態(tài)，使解折疊的蛋白質(zhì)重新折疊成有活性的構(gòu)型，這些小熱休克蛋白在提高植物耐熱性方面發(fā)揮著重要作用［2－3］。最近的研究表明，通過轉(zhuǎn)基因方法將sHSPs轉(zhuǎn)入植物后能提高植物的抗性［4］。定位于葉綠體的sHSPs通常有3個高度保守區(qū)域，分別命名為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ區(qū)域，前2個區(qū)域存在于所有的小熱休克蛋白中，而區(qū)域Ⅲ(富含甲硫氨酸)只存在于 CP-sHSPs中［5］。HARNDAHL 等［6］發(fā)現(xiàn)葉綠體sHSP內(nèi)富含甲硫氨酸的а-螺旋區(qū)域被氧化成為亞砜后，直接導(dǎo)致葉綠體sHSP寡聚體構(gòu)象的改變，隨之其類似分子伴侶功能丟失，而當(dāng)這些甲硫氨酸亞砜重新被還原后，葉綠體sHSP構(gòu)象及類似分子伴侶功能恢復(fù)。說明葉綠體sHSP內(nèi)這個特有的加Met保守區(qū)域?qū)τ诮Y(jié)合底物蛋白非常關(guān)鍵。因此，在脅迫條件下，這種結(jié)構(gòu)的變化可以保護植物免遭氧化脅迫［7－8］。HECKATHORN 等［9］在1998年證明了在番茄中葉綠體小分子熱激蛋白能夠在高溫逆境下提升PSⅡ整個電子傳遞鏈的電子傳遞速度，并且在高溫脅迫下對PSⅡ的保護作用發(fā)生很迅速。許多植物在氧化或高溫脅迫下都有CP-sHSP26的表達，以保護PSⅡ的光化學(xué)活性免受氧化和高溫脅迫的影響［4，7－8］。先前試驗已證明，玉米幼苗在高溫脅迫下可誘導(dǎo)sHSP26的高度表達［10］，但CP-sHSP26在高溫脅迫下的功能機制仍不清楚。因此，本研究以玉米品種鄭單958葉片為試驗材料，運用雙向電泳(2-DE)和質(zhì)譜分析等技術(shù)，確定高溫脅迫下與sHSP26相關(guān)的蛋白質(zhì)及其與葉綠體之間的關(guān)系。為研究CP-sHSP26保護玉米抗高溫脅迫的作用機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以耐干旱［11］玉米品種鄭單958為試驗材料，采用水培方式培養(yǎng)。用質(zhì)量分數(shù)為2%NaClO對玉米種子消毒10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后浸種8 h，然后在培養(yǎng)箱中28℃催芽1 d，隨后選取萌發(fā)一致的種子種在盛有培養(yǎng)介質(zhì)的周轉(zhuǎn)箱中，并放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱的溫度控制在28℃/22 ℃(晝/夜)，光合有效輻射為400 μmol.m－2.s－1，相對濕度(75±5)%，光周期14 h/10 h(晝/夜)。當(dāng)玉米幼苗的第2片葉完全展開后，對其進行高溫脅迫，高溫脅迫是將溫度從28℃以2℃·h－1升高至42℃并維持1 h，共處理8 h，隨后取下第2葉片用于葉綠體的制備。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 葉綠體的提取及完整度的檢測 依據(jù)MUNNE-BOSCH等［11］方法提取葉綠體。隨后使用熒光顯微鏡對葉綠體完整度進行檢測。

1.2.2 葉綠體的處理 因為sHSP26是誘導(dǎo)型蛋白，由核基因控制在高溫脅迫下表達，在此條件下我們分別用水、免疫球蛋白(IG)和AT-sHSP26處理純化的葉綠體。其比為1∶3 000，孵育30 min之后，40℃ 熱激 10 min，立即保存于 －80℃?zhèn)溆茫?1］。

1.2.3 葉綠體蛋白質(zhì)提取及含量的測定 葉綠體蛋白的提取采取 WANG等［12］方法，采用 BRADFORD［13］法測定蛋白質(zhì)的含量。

1.2.3 sHSP26 Western blot 分析 將含有 25 μg蛋白質(zhì)樣品在12.5%SDS-PAGE凝膠上電泳，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用抗玉米sHSP26多克隆抗體檢測 ，免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(山羊抗兔)進行檢測，印記使用3，3－二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色［14］。試驗至少重復(fù)3次。

1.2.4 2-DE 2-DE 采用 WANG 等［15］的方法。試驗至少重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和圖像分析 運用Excel 2003對所得數(shù)據(jù)進行處理。用軟件Image Master 2D Platinum 6.0(GE Healthcare公司)對凝膠雙向電泳圖像進行分析處理，包括背景的消減、斑點的檢測、匹配、分子質(zhì)量和等電點計算，獲取斑點位置坐標(biāo)及蛋白質(zhì)點量值的標(biāo)準(zhǔn)化分析等。

1.2.6 MALDI-TOF質(zhì)譜分析 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間(MALDI/TOF)質(zhì)譜分析待測定的雙向電泳蛋白點。將膠中差異顯著的蛋白點挖出，使用含500 ng胰蛋白酶的50 mmol· L－1碳酸氫銨(pH值8)在室溫酶解過夜后，對所得肽段依次使用體積分數(shù)1%三氟乙酸(TFA)的水溶液、含體積分數(shù)50%乙腈的0.2%TFA水溶液抽提、凍干后，再用ZipTipTMC18把肽段洗滌干凈，然后把肽段重新懸浮在10 μL的0.1%TFA水溶液中。Tip頭先用50%乙腈洗滌3次后再水化、再用0.1%TFA水溶液洗滌3次后進行平衡，平衡后吸入肽段溶液10次以確保結(jié)合。包含肽段的tip頭用0.1%TFA的水溶液洗滌3次，接著使用3 μL的50%乙腈/0.2%TFA水溶液把肽段洗脫下來。制備好的樣品在質(zhì)譜儀上采用反射模式分析的正離子譜測定，飛行管長2.7 m，離子源加速電壓為20 kV，反射電壓為23 kV，N2激光波長為377 nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100 ns，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，胰蛋白酶自切降解峰作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。

1.2.7 數(shù)據(jù)庫查詢和蛋白質(zhì)信息分析 用Mascot Distiller軟件(Matrixscience)對PMF圖譜進行單同位素峰識別，用Mascot軟件(Matrixscience，http://www.matrixscience.com)對獲得的肽段質(zhì)荷比 (m/z)數(shù)值進行檢索。用SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫 (http://www.expasy.org/sprot/)和 NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行搜索分析，進而得到蛋白質(zhì)的名稱、相對分子質(zhì)量(Mr)和等電點(pI)。在網(wǎng)站 http://workbench.sdsc.edu/中點擊Click to Enter the Biology Workbench 3.2進入蛋白質(zhì)工具(Protein tool)界面進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)等分析。

1.2.8 放氧速率的測定 應(yīng)用 Chlorolab-2液相氧電極系統(tǒng) (Hansatech，Norfolk，England)，在25 ℃含有 20 mmol· L－1NaHCO3的 50 mmol·L－1Tris-HCl buffer，pH 值7.5溶液中測定葉綠體的放氧速率，其光強為1 600 μmol·m－2·s－1［16］。試驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AT-sHSP26處理效果檢測

參照HECKATHORN等［9］方法用sHSP26抗體處理分離的葉綠體。為進一步檢測AT-sHSP26是否轉(zhuǎn)入玉米葉片葉綠體并發(fā)揮了作用，用免疫印跡技術(shù)分析了sHSP26的相對豐度，結(jié)果如圖1－A、圖1－B所示，經(jīng)AT-sHSP26處理后，sHSP26相對含量明顯降低。表明AT-sHSP26已成功轉(zhuǎn)入葉綠體并影響了sHSP26的含量。

圖1 玉米葉綠體蛋白sHSP26 western blot分析(A)及其相對強度分析(B)Fig.1 Western blot analysis of the sHSP26(A)and relative intensity(B)in maize chloroplast proteins

2.2 受sHSP26影響的葉綠體蛋白質(zhì)的鑒定

為了證明sHSP26對葉綠體蛋白質(zhì)的影響，提取葉綠體之后分別經(jīng)免疫球蛋白和AT－sHSP26處理，進行高溫處理后提取蛋白質(zhì)進行雙向電泳分離。經(jīng)雙向電泳圖譜比較分析發(fā)現(xiàn)24個差異蛋白點(圖3－A)，經(jīng)鑒定后表明屬于14個蛋白質(zhì)(表1)，根據(jù)其功能(表1)歸為6種類別:光反應(yīng)(42%)、ATP 合成(29%)、卡爾文循環(huán)(17%)、染色質(zhì)合成(4%)、脅迫蛋白(4%)和未知蛋白(4%)(圖4)。與IG處理相比，用 sHSP26抗體(AT－sHSP26)處理后，與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)(ATP合酶 α，β和 γ亞基、放氧增強子蛋白(OEE1)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、細胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫亞基、光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基Ⅳ4和鐵硫中心蛋白)表達下調(diào)(圖3－B)，說明高溫脅迫下這些蛋白質(zhì)受到了sHSP26的影響，同時證明了sHSP26保護了這些蛋白質(zhì)免受高溫的傷害，并在植物光合作用中扮演著至關(guān)重要的角色。

圖3 受sHSP26影響的葉綠體蛋白的鑒定Fig.3 Identify of chloroplast proteins affected by sHSP26

表1 高溫脅迫下受sHSP26影響的玉米葉綠體蛋白的鑒定Table 1 Identification of maize chloroplasts protein affected by sHSP26 under heat stress

續(xù)表Continuing table

2.4 sHSP26對葉綠體PSII中心放氧活性的影響

為了證明sHSP26對玉米葉綠體PSⅡ活性的影響，通過用sHSP26抗體(AT－sHSP26)和免疫球蛋白(IG)預(yù)處理玉米葉綠體后，再進行高溫處理，對上述制備的葉綠體進行放氧測定作為反應(yīng)葉綠體PSⅡ活性。結(jié)果顯示，高溫脅迫下其PSⅡ的放氧速率與IG處理相比明顯下降(圖5)。表明高溫脅迫下 sHSP26保護了 PSⅡ的活性，暗示了sHSP26具有提高PSⅡ抗高溫脅迫的能力。

圖4 高溫脅迫下已鑒定玉米葉綠體蛋白質(zhì)的功能分類Fig.4 Functional classification of maize chloroplasts protein identified under heat stress

圖5 玉米葉綠體的放氧速率Fig.5 The rate of O2evolution in maize chloroplasts

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中形成了許多調(diào)節(jié)機制來適應(yīng)周圍環(huán)境的脅迫，常常通過誘導(dǎo)和積累sHSPs達到增強抗性的目的［2］。目前對sHSPs的研究主要集中在不同脅迫條件誘導(dǎo)其表達，比如:干旱、高溫、氨基酸類似物、金屬、紫外線、ABA等［17－21］。在高等植物中，幾乎所有脅迫都能誘導(dǎo)sHSPs的表達，這些對研究植物響應(yīng)不同脅迫提供了新的依據(jù)。本實驗組先前研究證明，高溫脅迫下sHSP26在玉米葉片中大量表達，并參與熱激反應(yīng)［10］。在本研究中發(fā)現(xiàn)一些在高溫脅迫下受sHSP26保護的蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)主要參與光合作用中光反應(yīng)和卡爾文循環(huán)。光反應(yīng)主要由4種蛋白復(fù)合體來傳遞:PSⅡ、細胞色素b6/f復(fù)合體、PSⅠ和ATP合酶復(fù)合體。在本研究中，存在17個蛋白質(zhì)(點 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、18、19、21、22和24)參與光反應(yīng)，其中4個蛋白質(zhì)(點6、9、10 和12)屬于 PSⅡ，3 個蛋白質(zhì)(點 16、18 和21)屬于細胞色素b6/f復(fù)合體，3個蛋白質(zhì)(點19、22 和24)屬于 PSⅠ，7 個蛋白質(zhì)(點1、2、3、4、5、7和8)屬于ATP合酶復(fù)合體，另外有4個蛋白質(zhì)(點11、13、14和15)屬于卡爾文循環(huán)。

在植物中，熱損傷的主要指標(biāo)之一是放氧復(fù)合體(OEC)和PSⅡ中的相關(guān)輔助因子及固碳作用中的Rubisco酶和ATP合成系統(tǒng)［22］。放氧復(fù)合體蛋白包括OEE、OEE1和OEE2，屬于核編碼的葉綠體蛋白，在響應(yīng)高溫脅迫時 OEE表達上調(diào)［23］。CP-sHSPs不但能夠保護植物PSII和類囊體膜免受高溫脅迫，而且能保護光合電子傳遞和 OEC［24～26］。在藜中1個22 kD的CP-sHSPs能特異性與PSⅡ中耐熱OEC蛋白相互作用［27］，在高羊茅中，高溫脅迫下CP-HSP26過表達，顯著增加了PSⅡ(Fv/Fm)光化學(xué)活性［28］。在本研究中，AT-HSP26轉(zhuǎn)化后OEE1(點6)表達下調(diào)(圖3－B)，并且高溫脅迫下PSⅡ的放氧速率顯著降低(圖5)。前人研究顯示，在水稻和楊樹中，高溫脅迫顯著增加了葉綠體ATP合酶CF1的α鏈［29］。細胞色素b6/f復(fù)合體是光合電子傳遞鏈中非常重要的組分，包含許多小亞基，在PSⅡ到PSⅠ電子傳遞過程中發(fā)揮著重要作用［30］。細胞色素b6/f復(fù)合體可能參與了熱脅迫機制［31］。在本研究中，高溫脅迫下細胞色素b6/f復(fù)合體的鐵硫亞基表達增加，經(jīng)AT-sHSP26處理后其表達量降低(點16、18和21)(圖3－B)。果糖-1，6-二磷酸激酶(FBA)作為卡爾文循環(huán)中的1個酶，參與核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)的合成。高溫脅迫增加FBA的表達或許可以維持CO2的累積效率［25］。本研究中，高溫脅迫下FBA表達上調(diào)，用AT-sHSP26處理后，抑制FBA表達量的增加(圖3-B)。高溫脅迫增加了整個電子傳遞效率，Ab(met)和Ab(a)的加入，均降低了高溫下電子傳遞速率［9］。同樣在本研究中，用AT-sHSP26處理后光合反應(yīng)速率明顯降低(圖5)，說明sHSP26保護了高溫脅迫對PSⅡ的損傷。

本研究顯示，sHSP26與玉米葉綠體蛋白質(zhì)在高溫脅迫下的相關(guān)性，sHSP26能夠維持PSⅡ功能的穩(wěn)定和能量的合成，使玉米葉片免受高溫脅迫的損傷。本研究結(jié)果為揭示脅迫應(yīng)答反應(yīng)中蛋白互作提供了重要的依據(jù)，為進一步闡明sHSP26保護玉米葉綠體的功能及闡明光合作用機制提供了理論依據(jù)。

［1］ RASUL G，CHAUDHRY Q Z，MAHMOOD A，et al.Effect of temperature rise on crop growth and productivity［J］.Pakistan J Meteorol，2011，8(15):53 －62.

［2］ SUN W，MOTANGU M V，VERBRUGGEN N.Small heat shock proteins and stress tolerance in plants［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2002，1577(1):1－9.

［3］ JAYA N，GARCIA V，VIRLING E.Substrate binding site flexibility of the small heat shock protein molecular chaperones［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(37):15604－15609.

［4］ CHAUHAN H，KHURANA N，NIJHAVAN A，et al.The wheatchloroplastic smallheatshock protein(sHSP26)is involved in seed maturation and germination and imparts tolerance to heat stress［J］.Plant Cell Environ，2012，35(11):1912－1931.

［5］ CHEN Q，VIERLING E.Analysis of conserved domains identifies a unique structural feature of a chloroplast heat shock protein［J］.Mol Gen Genet，1991，226(3):425－431.

［6］ HARNDAHL U，KOKKE B P，GUSTAVSSON N，et al.The chaperone-like activity of small heat shock protein is lost after sulfoxdation on conserved methionines in surface-exposed amphipathic а-helix［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1545(1 －2):227 －337.

［7］ LEE B H，WON S H，LEE H S，et al.Expression of the chloroplast-localized small heat shock protein by oxidative stress in rice［J］.Gene，2000，245(2):283 － 290.

［8］ H RNDAHL U，BUFFONI-HALL R，OSTERYOUNG K W，et al.The chloroplasst heat shock protein undergoes oxidation-dependent conformational changes and may protect plants against oxidative stress［J］.Cell Stress Chaperon，1999，4(2):129－138.

［9］ SCOTT A H，CRAIG A D，THOMAS D S.et al.The small，methionine-rich chloroplast heat-shock protein protects photosystem II electron transport during heat stress［J］.Plant Physiol，1998，116(1):439 －444.

［10］ HU X L，LI Y H，LI C H，et al.Characterization of small heat shock proteins associated with maize tolerance to combined drought and heat stress［J］.J Plant Growth Regul，2010，29(4):455 －464.

［11］ MUNNE-BOSCH S，ALEGRE L.Drought-induced changes in the redox state of-tocopherol，ascorbate and the diterpene carnosic acid in chloroplasts of labiatae species differing in carnisic acid contents［J］.Plant Physiology，2003，131(4):1816－1825.

［12］WANG W，VIGNANI R，SCALI M，et al.Auniversal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues proteomic analysis［J］.Electrophoresis，2006，27(13):2782－2786.

［13］BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical.Biochemisry，1976，72:248－254.

［14］ HU X L，LIU R X，LI Y H，et al.Heat shock protein 70 regulates the absciisic acid-induced antioxidant response of maize to drought and heat stress combination［J］.PlantGrowthRegulation， 2010， 60(3):225－235.

［15］ WANG W，WU X L，XIONG E H，et al.Improving gel-based proteome analysis of soluble protein extracts by heat prefractionation［J］.Proteomics，2012，12(7):938－943.

［16］ ZHANG Z S，LI G，GAO H Y，et al.Characterization of photosynthetic performance during senescence in staygreen and quick-leaf-senescence Zea mays L.Inbred Line［J］.Plos One.2013，7(8):e42936.

［17］ LINDQUIST S，CRAIG E A.The heat-shock proteins［J］.Annu.Rev.Genet，1998，22(1):631 －677.

［18］ VIERLING E.The role of heat shock proteins in plants［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1991，42(1):579－620.

［19］ BANZET N，RICHAUD C，DEVEAUX Y，et al.Accumulation of small heat shock proteins，including smitochondrial HSP22，induced by oxidative stress and adaptive response in tomato cells［J］.Plant J，1998，13(4):519－527.

［20］HU X L，LU M H，LI C H，et al.Differential expression of proteins in maize roots in response to abscisic acid and drought［J］.Acta Physiol Plant，2011，33(6):2437－2446.

［21］ LIU T X，ZHANG L，YUAN Z L，et al.Indentification of proteins regulated by ABA in response to combined drought and heat stress in maize roots.Zea mays L.inbred lines［J］.Plos One，2013，25(2):e42936.

［22］ ALLAKHVERDIEV S I，KRESLAVSKI V D，KLIMOV V V，et al.Heat stress:an overview of molecular responses in photosynthesis［J］.Photosynth Res，2008，98(1):541－550.

［23］ LI W M，WEI Z W，QIAO Z H，et al.Proteomics analysis of alfalfa response to heat stress［J］.Plos One，2013，8(12):e82725.

［24］ HAQ NU，AMMAR M，BANO A，et al.Molecular characterization of chenopodium album chloroplast small heat shock protein and its 460 expression in response to different abiotic stresses［J］.Plant Mol Biol Rep，2013，31(6):1230－1241.

［25］ HECKATHORN S A，DOWNS C A，Coleman A J S.Small heat shock proteins protect electron 463 transport in chloroplasts and mitochondria during stress［J］.Am Zool，1999，39(6):865 －876.

［26］ T R K Z，GOLOUBINOFF P，HORVATH I，et al.Synechocystis HSP17 is an amphitropic protein that stabilizes heat-stressed membranes and binds denatured proteins for subsequent chaperone-mediated refolding［J］.Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of USA，2001，98(6):3098－3103.

［27］ DOWNS C A，COLEMAN J S，HECKATHORN S A.The chloroplast 22-Ku heat-shock protein:a lumenal protein that associates with the oxygen evolving complex and protects photosystemⅡ during heat stress［J］.J Plant Physiol，1999，155:477 －487.

［28］ KIM K H，ALAM I，Kim Y G，et al.Overexpression of a chloroplast-localized small heat shock protein OsHSP26 confers enhanced tolerance against oxidative and heat stresses in tall fescue［J］.Biotechnol.Lett，2012，34(2):371－377.

［29］ FERREIRA S，HJERNO K，LARSER M，et al.Proteome profiling of Populus euphratica Oliv upon heat stress［J］.Ann Bot，2006，98(2):361 －377.

［30］ CRAMER W A，ZHANG H，YAN J，et al.Transmembrane traffic in the cytochrome b6/f complex［J］.Annu.Rev.Biochem，2006，75(1):769－790.

［31］ BOUCHER N，HARNOIS J，CARPENTIER R.Heatstress stimulation of electron flow in a photosystemⅠsubmembrane fraction［J］.Biochem Cell Biol，1990，68(7－8):999－1004.