抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的兩種檢測方法比較

卓淑發(fā)

（廣東省惠州市衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，廣東惠州516025）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的兩種檢測方法比較

卓淑發(fā)

（廣東省惠州市衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，廣東惠州516025）

目的：比較線性免疫分析法（LIA）與間接免疫熒光法（ⅡF）檢測抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）的性能，評價兩種方法在ANCA檢測中的應(yīng)用效果。方法：用LIA法和ⅡF法對92份自身免疫性疾病患者血清和160份健康獻(xiàn)血者血清進(jìn)行檢測，用，檢驗，對兩種方法結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果：LIA法陽性率為6.4% （16/252），其中PR3陽性率為2.4%（6/252），MPO陽性率為4.0%（10/252）；ⅡF法陽性率為8.7%（22/252），其中C-ANCA陽性率為3.5%（9/252），P-ANCA陽性率為5.2%（13/252）。在經(jīng)確證為血管炎的19例標(biāo)本中，LIA法檢出陽性16例，假陰性3例，敏感性為84.2%（16/19），準(zhǔn)確性為100%（16/16）；ⅡF法檢出陽性23例，假陽性4例，敏感性為94.7%（18/19），準(zhǔn)確性為81.8%（19/23）。兩種方法的敏感性和準(zhǔn)確性比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：兩種方法檢測ANCA的陽性率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但ⅡF法相對敏感，LIA法有較高的準(zhǔn)確性，兩者聯(lián)舍檢測可提高ANCA的檢出質(zhì)量。

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體；線性免疫分析法；間接免疫熒光法

ANCA是一種針對中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成分的自身抗體，臨床上主要用于診斷Wegener肉芽腫﹑原發(fā)性小血管炎﹑炎性腸病等系統(tǒng)性血管炎疾病[1]，現(xiàn)已成為臨床常規(guī)檢測項目。目前常用測定ANCA的方法有ⅡF，ⅡF可將ANCA分為胞漿型抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（C-ANCA）和核周型抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（P-ANCA），而蛋白水解酶3（PR3）是C-ANCA的靶抗原，髓細(xì)胞過氧化物酶（MPO）為P-ANCA靶抗原[2]。作者采用LIA和ⅡF法對252份血清ANCA進(jìn)行檢測比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

252份血清標(biāo)本來自臨床不同患者和健康獻(xiàn)血者，其中92例患者包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡40例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎21例，血管炎19例，系統(tǒng)性硬化病7例，干燥綜合征5例，以上病例均符合1982年美國風(fēng)濕病協(xié)會（ACR）修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

（1）標(biāo)本采集。靜脈取血4～5 ml，置干燥試管中待凝固后分離血清，-20 ℃保存。

（2）線性免疫分析法（LIA）。本試劑由德國IMTEC公司原裝生產(chǎn)。將核抗原印跡于硝化纖維膜上，封閉非特異反應(yīng)區(qū)，纖維膜然后被切割成膜條。模條上的抗原與特異性抗體縮合后除去未結(jié)合蛋白，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG二抗與之結(jié)合，最后加入無色的TMB底物，結(jié)合抗體表現(xiàn)為可見的藍(lán)色免疫復(fù)合物。結(jié)果判斷：待膜條完全干燥后與試劑盒提供的判讀卡比較Cut-Off，PR3，MPO三條帶。陽性結(jié)果：條帶顏色比Cut-Off相同或更深；陰性結(jié)果：條帶顏色比Cut-Off淺。

（3）間接免疫熒光法（ⅡF）。使用歐蒙公司的粒細(xì)胞馬賽克試劑盒，每張生物載片上包被有乙醇﹑甲醛固定的粒細(xì)胞，血清及抗體均用PBS（pH 7.2）稀釋，加1:10稀釋待測血清﹑陰性﹑陽性對照血清，溫育洗滌后加異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗人IgG，溫育洗滌后，滴加甘油用蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下讀片。結(jié)果判定：中性粒細(xì)胞不出現(xiàn)特異性熒光為抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）陰性。胞漿型抗中性粒細(xì)胞抗體（cANCA）阻性：顯示均勻分布在整個中性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒型熒光，細(xì)胞核無熒光。核周型抗中性粒細(xì)胞抗體（pANCA）陽性：在中性粒細(xì)胞核周顯示光滑的帶狀熒光。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對92份患者血清和160份健康獻(xiàn)血者血清進(jìn)行檢測結(jié)果比較

LIA法陽性率為6.4%（16/252），其中PR3陽性率為2.4% （6/252），MPO陽性率為4.0%（10/252）；ⅡF法ANCA陽性率為8.7%（22/252），其中C-ANCA陽性3.5%（9/252），P-ANCA陽性率為5.2%（13/252）。兩種方法檢測陽性率用χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 LIA與ⅡF檢測結(jié)果陽性率比較

2.2 敏感性與準(zhǔn)確性

252例標(biāo)本中19例確證為血管炎。LIA法檢出陽性16例均確證為血管炎，敏感性為84.2%（16/19），準(zhǔn)確性為100%（16/16），假陰性3例；ⅡF法檢出陽性22例包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎1例，血管炎18例和系統(tǒng)性硬化病1例，敏感性為94.7%（18/19），準(zhǔn)確性為81.8%（18/22），假陽性4例。LIA法和ⅡF法的敏感性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），準(zhǔn)確性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 LIA法和ⅡF法檢測結(jié)果比較

3 討論

NCA為血管炎的一項敏感的血清學(xué)標(biāo)志。本研究結(jié)果如表1顯示，LIA法中PR3陽性率為2.4%，MPO陽性率為4.0%；ⅡF法中C-ANCA陽性率3.5%，P-ANCA陽性率為5.2%，兩種方法檢測陽性率差異比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。目前有10余種中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成分被證實(shí)為ANCA昀靶抗原[2]，還有許多未知的靶抗原待確定。LIA法抗原成分經(jīng)重組純化后標(biāo)記，有針對性地檢測PR3和MPO兩種ANCA的靶抗原。但LIA法對PR3和MPO以外的ANCA靶抗原會漏檢。目前ⅡF法是檢測ANCA的常用方法。隨著對ANCA的深入研究，發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的疾病越來越多，ⅡF法檢出的ANCA陽性并不一定意味著血管炎[3]。ⅡF法檢出4例假陽性包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例﹑類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎1例和系統(tǒng)性硬化病1例。由于乙醇固定的中性粒細(xì)胞中同時存在線粒體﹑高爾基體以及核糖體P蛋白等，若被檢血清存在相應(yīng)自身抗體則可與之結(jié)合，會呈現(xiàn)強(qiáng)弱不等的熒光，影響對ANCA的檢測[4]。由表2可見，ⅡF法敏感性為94.7%，較LIA法敏感性要高。但LIA法相比ⅡF法具有較高的準(zhǔn)確性。

自身免疫病本身有大量自身抗體表達(dá)，特別是ANA滴度較高時，鑒別非常困難。從而增加了假陽性率，降低了特異度。ⅡF法檢測ANCA相對敏感，雖然它能區(qū)分P-ANCA 和C-ANCA，但不能準(zhǔn)確地區(qū)分出屬于哪一種靶抗原相關(guān)性抗體，故可作為篩選試驗。LIA法能特異地檢測PR3-ANCA與MPO-ANCA，但不可替代ⅡF法檢測總ANCA。因此LIA法可作為ⅡF法的有效補(bǔ)充，進(jìn)一步提高ANCA檢測的敏感性和準(zhǔn)確性。

［1］ 趙秀芬，孫彬，錢軍，等.抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的檢測方法及臨床意義[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2908，12（6）：79.

［2］ 陳武.間接免疫熒光法與酶聯(lián)免疫吸附試驗對比檢測抗核抗體[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2006，3（7）：374.

［3］ 羅冰，王艾麗，虞偉.4種自身抗體對問接免疫熒光法檢測抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體的影響[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2009，22（2）：124.

［4］ 王濤，李季青，陳琳潔.線性免疫分析法檢測39例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清抗核抗體譜結(jié)果分析[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（15）：2426.

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1002-2376（2015）12-0146-02

2015-08-30