成人骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性

王翔毅 栗濟深 劉福泉 劉來興 陸鈺 朱玉德

成人骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性

王翔毅 栗濟深 劉福泉 劉來興 陸鈺 朱玉德

目的 探索體外培養(yǎng)腦出血后遺癥患者骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)的方法及擴增后的生物學(xué)特性。方法 取腦出血后3個月以上患者髂骨骨髓組織, 去除淋巴細胞后采用靜置貼壁培養(yǎng)法接種培養(yǎng),經(jīng)多次換液純化。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài), 取第3、6代應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD105因子的表達。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下接種48 h后, 發(fā)現(xiàn)少數(shù)細胞貼壁, 呈梭形, 6～8 d后細胞形成集落。傳代后, 細胞形態(tài)趨于一致, 可成漩渦狀。流式細胞儀檢測顯示CD34、CD45陰性,而CD29、CD105陽性。結(jié)論 體外密度梯度離心法和貼壁靜置可以獲得大量高度均一的表型符合骨髓基質(zhì)細胞的細胞。

骨髓基質(zhì)細胞；細胞培養(yǎng)；表面抗原

細胞移植開辟了一條治療腦損傷后遺癥的途徑, 目前發(fā)現(xiàn)BMSCs植入后會改變損傷區(qū)的局部環(huán)境, 通過自分泌和旁分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來保證自身的存活和促發(fā)內(nèi)源修復(fù)［1］。骨髓基質(zhì)細胞是成體干細胞,與其他的干細胞相比有顯著的優(yōu)越性,是細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細胞之一。由于骨髓中細胞成分比較混雜, BMSCs在骨髓中含量極少,僅占骨髓中有核細胞的 0.001%～0.01%, 實際應(yīng)用中需對其進行體外分離純化并大量擴增［2］。本實驗對人BMSCs進行體外分離培養(yǎng), 并對培養(yǎng)細胞的表面抗原進行測定, 為臨床應(yīng)用提供足量有活性的骨髓基質(zhì)細胞?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque (1.077 g/ml, 上海試劑二廠), DMEM/F12培養(yǎng)基 (Gibco), 胰蛋白酶(Gibco), 胎牛血清(Hyclone), 異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD105(Immunotech), Caliber 流式細胞儀(BD公司)、倒置相差顯微鏡(Nikon)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus),低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs獲得和培養(yǎng) 骨髓來源：病例1, 54歲, 男,高血壓腦出血患者, 行髂骨嵴骨髓穿刺獲得, 無菌抽取, 肝素抗凝的骨髓中加入等體積的無鈣鎂磷酸緩沖液, Ficoll分離,取單個核細胞層, 用無鈣鎂磷酸緩沖液洗滌2次, DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌1次, 以1×106/ml的細胞密度接種, 用含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng), 第1次72 h后更換新鮮培養(yǎng)基, 去除未貼壁細胞并繼續(xù)培養(yǎng), 后每3～4天換液1次, 以去除未貼壁細胞。連續(xù)培養(yǎng)2周后, 當基質(zhì)細胞貼壁約80%時, 按照1：2比例傳代。通過傳代, 對BMSCs進行純化和擴增, 取第3、6代的細胞用于流式檢測。體外培養(yǎng)的BMSCs采用倒置相差顯微鏡, 逐日觀察細胞生長情況和形態(tài)特征。

1.2.2 BMSCs表面抗原檢測 采用直接免疫熒光染色流式細胞術(shù), 測定BMSCs表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng) BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下, 剛接種的骨髓懸液中含有大量懸浮細胞, 無細胞貼壁；48 h后,發(fā)現(xiàn)少數(shù)細胞貼壁, 呈梭形。72 h后換液, 將未貼壁細胞棄去。貼壁細胞呈克隆性生長, 細胞增殖后形態(tài)多樣, 呈異質(zhì)性,以長梭形細胞為主, 亦可見三角形、多角形及扁圓形細胞。6～8 d后細胞形成集落。傳代后, 細胞形態(tài)趨于一致, 呈長梭形, 細胞排列緊密, 可成漩渦狀。見圖1。細胞傳至第12代時, 胞漿內(nèi)顆粒物增多, 細胞折光性變差, 提示細胞活力變?nèi)? 增殖能力減弱。

圖1 體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞

2.2 BMSCs細胞表面抗原檢測結(jié)果 流式細胞儀分析BMSCs表面抗原, 流式細胞儀檢測顯示CD34、CD45陰性為非造血細胞, 且表達率在3代時(2.52%、2.07%)%較6代時(0.32%、0.14%)高, 說明第6代幾乎為純基質(zhì)細胞。而CD29、CD105陽性說明BMSCs較為幼稚, 且3代和6代數(shù)值無差異。

3 討論

研究已明確BMSCs是成體干細胞的一種, 但細胞成分不單一, 有可能包含不同分化階段的前體細胞的混合物［2,3］。BMSCs也具有自我更新能力及多向分化潛能, 在體外經(jīng)誘導(dǎo)可以分化為骨、軟骨、脂肪組織、神經(jīng)組織及肝組織等。由于骨髓來源豐富, 取材方便, 創(chuàng)傷小, 在組織再生和損傷修復(fù)中有很好的臨床應(yīng)用前景［1］。

BMSCs廣泛存在于胎兒和成人的各種組織和臟器中, 骨髓組織中含量最為豐富, 為了獲取種子細胞, 目前用于分離骨髓BMSCs的方法主要有：密度梯度離心法；流式細胞儀分選法；貼壁培養(yǎng)法；免疫磁珠分選法。作者用密度梯度分離聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法進行了BMSCs的分離和培養(yǎng), 其操作簡單, 經(jīng)多次傳代可獲得足夠量的細胞。流式細胞儀檢測顯示CD34、CD45均陰性, 傳3代時表達率分別為2.52%和2.07%,較6代時0.32%和0.14%高, 說明第6代幾乎為純基質(zhì)細胞。

研究表明BMSCs的表面標志尚無特異性表面標志表達,部分與間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和表皮細胞的表面標志有關(guān)［4-6］。主要包括：①粘附分子, 如CD44等。②生長因子和細胞因子受體, 如IL受體3、4、6、7, 干擾素γ受體等。③整合素家族成員, 包括CD49a、CD49b、CD49c及CD29、CD104等。④如CD90、CD105等。實驗選用的標記物也符合鑒定BMSCs通用標志物, 因此, 本實驗培養(yǎng)細胞符合BMSCs的免疫表型。

BMSCs具有多向分化潛能, 在細胞移植和基因治療方面有重要優(yōu)勢。本實驗成功對BMSCs 進行分離、純化及培養(yǎng),為深入研究 BMSCs 的組織再生和修復(fù)提供了實驗基礎(chǔ)。

［1］ Vaquero J, Zurita M.Functional recovery after severe CNS trauma: current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells.Prog Neurobiol, 2011, 93(3):341-349.

［2］ 閆冬梅,徐開林,杜冰,等.人骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)及鑒定.臨床血液學(xué)雜志, 2009, 22(3):144-146.

［3］ 胡學(xué)昱,羅卓荊,田爽,等.成人骨髓基質(zhì)細胞體外誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞實驗研究.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2006, 5(2): 139-142.

［4］ 謝謙, 羅莉.成人正常骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性.口腔醫(yī)學(xué)研究, 2004, 20(2):153-155.

［5］ 戚曉淵,孫澤林,劉方軍.單克隆永生化人骨髓基質(zhì)干細胞分化能力和VEGF分泌量的相關(guān)性.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2011,91(17): 1193-1196.

［6］ Jung S, Panchalingam KM, Wuerth RD, et al.Large-scale production of human mesenchymal stem cells for clinical applications.Biotechnol Appl Biochem, 2012, 59(2):106-120.

In vitro culture of adult marrow stroma cell and its biological characteristics

WANG Xiang-yi, LI Jishen, LIU Fu-quan, et al.Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Baotou 014010, China

Objective To explore in vitro culture method of human bone mesenchymal stem cells (BMSCs) of cerebral hemorrhage sequelae patients and its amplified biological characteristics.Methods Ilium myeloid tissues were taken from patients with 3-month cerebral hemorrhage sequelae, and they were in adherence standing culture after removing the lymphocyte, and multiple liquid purification.Morphology and growth characteristics were examined by inverted phase contrast microscope.Cell surface markers CD29, CD34, CD45, and CD105in the third and sixth generation were tested by flow cytometer.Results After 48 h of phase contrast microscopy inoculate, there were several spindle-shaped cells.After 6～8 d, cells were in colony.After passage, cellular morphology tended to be conform and swirling.Flow cytometer showed that CD34and CD45were positive, while CD29and CD105were negative.Conclusion In vitro density gradient centrifugation and adherence standing method can provide a large number of homogeneous BMSCs.

Marrow stroma cell; Cell culture; Surface antigen

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.005

2014-08-27］

內(nèi)蒙古自然基金資助(項目編號：2010MS1135)

014010 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

朱玉德