快速實時熒光定量PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒方法的建立

吳海港,饒品彬,蔡 曄,全滟平,姜永厚

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018)

快速實時熒光定量PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒方法的建立

吳海港,饒品彬,蔡 曄,全滟平,姜永厚

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018)

為建立一種快速準確檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)的基于TaqMan實時熒光定量PCR方法,根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的ORF7保守序列分別設(shè)計引物和TaqMan探針,在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上,設(shè)計并優(yōu)化基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測PRRSV的方法。結(jié)果表明本研究建立的基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR體系相關(guān)系數(shù)大于99%,擴增效率為97%,具有良好的線性關(guān)系。利用建立的方法檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV),結(jié)果均為陰性,說明此方法具有較好的特異性。靈敏度試驗表明該方法檢測極限為5 copies/μL;應(yīng)用建立的方法對58份血清樣本和60份組織樣本進行檢測,共檢測出14份陽性血清和10份陽性組織。這些結(jié)果表明本研究建立的基于TaqMan探針的PRRSV實時熒光定量PCR方法具有良好的特異性、靈敏度、重復(fù)性,可為臨床檢測PRRSV提供更高效的技術(shù)平臺。

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒; TaqMan探針; 實時熒光定量PCR; 檢測

0 引 言

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合癥(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的主要病原,該病是一種對養(yǎng)豬業(yè)危害極其嚴重的病毒性傳染病,臨床特征為母豬發(fā)熱、流產(chǎn),斷奶前、后仔豬死亡,呼吸障礙等,又稱“藍耳病”[1]。PRRS一般僅見于豬,其他家禽和動物未見發(fā)病,該病潛伏期短,從感染到出現(xiàn)病癥間隔大約為2～37 d,不同年齡、品種的豬均可感染,嚴重可致豬體免疫系統(tǒng)功能喪失而死亡,屬于一旦發(fā)現(xiàn)必須向世界動物衛(wèi)生組織(office international des epizooties,OIE)通報的烈性傳染病。根據(jù)核苷酸序列差異不同分為2個亞型,亞型A為1991年荷蘭學(xué)者Wensvoort等[2]在病豬體內(nèi)分離的歐洲型PRRSV,主要流行于歐洲地區(qū),亞型B為同年美國學(xué)者Benfield等[3]分離到的美洲型PRRSV,主要流行于美洲和亞太地區(qū)。PRRSV具有高度的傳染性,能垂直傳播和水平傳播,致使該病在各養(yǎng)豬國家蔓延,造成了極大的經(jīng)濟損失,引起了世界各國政府的高度重視。

目前已建立的檢測PRRSV方法有很多,如病毒分離培養(yǎng),免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique,IFA),免疫過氧化物酶單層試驗(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),血清中和試驗(serum neutralization test,SNT),酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等。這些方法存在耗時長,技術(shù)要求高,或靈敏度低,不能在病毒潛伏期進行有效檢測等不足。實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR)的出現(xiàn)極大地簡化了核酸檢測過程。實時熒光定量PCR技術(shù)是1996年美國Applied Biosystem公司新推出的核酸定量技術(shù),該技術(shù)通過熒光染料或熒光探針對PCR產(chǎn)物進行跟蹤標記,再結(jié)合相應(yīng)軟件對產(chǎn)物進行分析,對未知模板初始濃度進行定量[4]。因?qū)崟r熒光定量PCR自動化程度高,目前已廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷、動物疫病監(jiān)測、食品安全和科學(xué)研究。本研究旨在根據(jù)實時熒光定量PCR原理,利用TaqMan探針技術(shù)設(shè)計和建立一種快速檢測PRRSV方法,為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的早期診斷提供工具,同時也為豬繁殖與呼吸綜合癥的分子生物學(xué)、致病機理和流行病學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

PRRSV、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)及豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗株由本實驗室保存;豬細小病毒(porcine parvovirus,PPV)疫苗干粉購自北京中海保健科技有限公司;偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)和日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗干粉購自武漢科前動物生物制品有限公司;大腸桿菌E.coliDH5α,本實驗室保存,58份來自全國各地區(qū)血清樣品和60份采集于杭州屠宰場的組織樣本。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶,dNTP mixture,質(zhì)粒pMD18-T,DNA Gel Extraction Kit為生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品,M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶,RNase抑制劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 引物與TaqMan探針設(shè)計

根據(jù)GenBank下載PRRSV序列的Clustal-W (DNAStar Inc.,Madison,WI,USA)比對結(jié)果,選取保守的ORF7基因,利用Primer Premier 5.0 (Prmier Biosoft international,USA)設(shè)計ORF7 PCR引物,ORF7上游引物5′-GAGTTTCAGCGGAACAATGG-3′,ORF7下游引物5′-GCCGTTGACCGTAGTGGAG-3′。在上述引物區(qū)內(nèi)設(shè)計熒光定量PCR引物和TaqMan探針(表1)。通過NCBI中BLAST對設(shè)計的引物和探針進行分析,確保引物和探針的特異性。設(shè)計的引物和探針由上海生工生物工程公司合成。

表1 實時熒光定量PCR引物和探針

1.4 病毒質(zhì)粒標準品制備

1.4.1 ORF7基因的擴增

根據(jù)產(chǎn)品說明,用病毒RNA抽提試劑盒從疫苗株樣本提取病毒核酸。以提取的核酸產(chǎn)物為模板,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如下:10×Taq PCR Buffer 2.5 μL,Mg2+(25 mM)2 μL,dNTP(2.5 mM)1 μL,上、下游引物(10 μM) 0.5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL,cDNA模板1 μL,加ddH2O至總體積為25 μL。反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán);72℃ 10 min,瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定

按照凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,與pMD18-T載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α,挑選轉(zhuǎn)化的菌落進行單克隆培養(yǎng),提取質(zhì)粒進行酶切鑒定以及序列測定。

1.4.3 重組質(zhì)粒濃度的測定

將質(zhì)粒提取物用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度,并根據(jù)公式計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。將質(zhì)粒標準品以10倍比稀釋后用于標準曲線的制作。

1.5 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.5.1 標準曲線的建立

將重組質(zhì)粒按照10倍梯度稀釋,取5個梯度的質(zhì)粒標準品作為實時熒光定量PCR反應(yīng)模板進行反應(yīng),制作標準曲線。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為15 μL,反應(yīng)體系組成為:25 mM Mg2+2.1 μL,10×Buffer 1.5 μL,2.5 mM dNTP Mix 1.2 μL,0.2 U Taq聚合酶,上、下游引物(10 μM)各0.3 μL,探針(10 μM) 0.15 μL,重組質(zhì)粒1 μL,滅菌ddH2O補足15 μL。反應(yīng)在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行,擴增程序為:95℃ 3 min;95℃ 15 s,60℃ 1min,40個循環(huán)。

1.5.2 實時熒光定量PCR方法的特異性試驗

分別以PRRSV、PCV2、PPV、PRV、CSFV和JEV所抽提的DNA或cDNA以及雙蒸水為模板進行熒光定量PCR檢測,檢驗其反應(yīng)特異性。

1.5.3 實時熒光定量PCR方法的靈敏性試驗

用含有目的片段的質(zhì)粒作標準品,以10倍系列稀釋成1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、5.0×100、1.0×100copies/μL為模板和雙蒸水進行熒光定量PCR檢測,檢驗其靈敏度。

1.5.4 實時熒光定量PCR方法的重復(fù)性試驗

將含有目的片段的3個濃度梯度(106、105、104copies/μL)的質(zhì)粒標準品分別重復(fù)做批內(nèi)實時熒光定量PCR反應(yīng)3次,并在不同時間內(nèi)分別進行3次批間實時熒光定量PCR反應(yīng),對PRRSV各濃度標準品的Ct值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線建立

構(gòu)建的含PRRSV目的片段的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序,BLAST在線比對分析,驗證了本研究克隆的DNA序列確實為PRRSV的部分核酸序列,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(結(jié)果未列出)。以制備的PRRSV標準品梯度稀釋成106、105、104、103、102copies/μL,以這5個濃度的標準品作為模板進行熒光定量PCR反應(yīng),對擴增曲線進行分析制作標準曲線,結(jié)果表明模板濃度在106～102copies/μL范圍熒光定量PCR反應(yīng)可獲得理想的標準曲線,相關(guān)系數(shù)大于0.99,擴增效率達到97%(圖1)。

圖1 PRRSV熒光定量PCR擴增標準曲線

2.2 特異性

用建立的熒光定量PCR方法分別對PRRSV,PCV2、PRV、PPV、CSFV和JEV進行檢測,PRRSV有擴增曲線產(chǎn)生,而以PCV2、PRV、PPV、CSFV和JEV為模板的對照組均無擴增曲線,空白陰性對照無擴增曲線(圖2),結(jié)果表明PRRSV實時熒光定量PCR具有較好的反應(yīng)特異性。

圖2 PRRSV實時熒光定量PCR反應(yīng)特異性

3.3 靈敏度

以濃度分別為106、105、104、103、102、10和5 copies/μL的PRRSV標準品作為模板時擴增曲線均有陽性信號產(chǎn)生,1 copies/μL的PRRSV標準品無擴增曲線(圖3),表明PRRSV實時熒光定量PCR的檢測靈敏度可以達到5 copies/μL。

圖3 PRRSV實時熒光定量PCR檢測靈敏度注:1.106copies/μL;2.105copies/μL;3.104copies/μL;4.103copies/μL;5.102copies/μL;6.10copies/μL;7.5copies/μL。

3.4 重復(fù)性

將制備的PRRSV標準品梯度稀釋成106、105、104copies/μL,以這3個濃度的標準品作為模板分別進行實時熒光定量PCR重復(fù)性試驗,對標準品的擴增曲線相應(yīng)Ct值進行統(tǒng)計分析(表2),批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)分別為0.57%、1.85%和1.50%,小于3%;批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)分別為3.26%、3.99%和3.18%,小于5%,表明實時熒光定量PCR檢測PRRSV具有良好的重復(fù)性。

表2 實時熒光定量PCR檢測PRRSV重復(fù)性

3.5 臨床檢測

利用建立的PRRSV實時熒光定量PCR方法檢測來自不同地區(qū)的58份血清樣品和60份來自浙江杭州地區(qū)的組織樣本,檢測結(jié)果顯示血清樣品中有14份陽性,組織樣品中有10份陽性。

4 討 論

實時熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)PCR相比具有下列優(yōu)勢:a)定量檢測,常規(guī)PCR只能通過膠成像分析終點法對擴增產(chǎn)物進行定性分析,而實時熒光定量PCR技術(shù)利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,最終精確地對起始模板進行定量分析;b)具有良好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，在本試驗中,經(jīng)過多次重復(fù)試驗,批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)的變異系數(shù)分別小于2%和5%。而常規(guī)PCR電泳后通過掃描凝膠定量,其變異系數(shù)高達31%[5];c)安全省時,實時熒光定量PCR技術(shù)省去了常規(guī)PCR中的電泳、染色等后續(xù)步驟,避免了溴化乙錠或同位素等對人體健康的危害,同時簡化了實驗程序,減少了實驗環(huán)境對產(chǎn)物的污染,適宜于大批量樣本的檢測;d)高精確度,實時熒光定量PCR的檢測始模板量,在模板含量較低時也能得到精確結(jié)果,比半定量PCR更可靠,有利于制定定量檢測標準,便于在不同實驗室之間進行結(jié)果比較。

PRRSV ORF7編碼核衣殼蛋白,即N蛋白,具有很強的保守性,N蛋白包含所有毒株保守的共同表位,又具有歐洲型和美洲型PRRSV的表位[6-8]。本研究選用相對保守的N蛋白基因,建立了基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR檢測PRRSV方法。TaqMan探針技術(shù)在引物和探針設(shè)計方面都具有較高的特異性,所以具有雙重保障,即擴增的產(chǎn)物是由一對特異性引物和特異性探針共同決定。另外,TaqMan探針技術(shù)的引物二聚體不會產(chǎn)生熒光,而TaqMan探針的3′端已經(jīng)磷酸化,不能形成二聚體,所以不會對特異性產(chǎn)生影響[9]。本實驗中對PRRSV和其它5種常見豬病毒進行檢測,除目標病毒外均為陰性,表明建立的實時熒光定量PCR具有較好的特異性,可有效減少假陽性的發(fā)生。

病毒檢測方法的靈敏度對豬呼吸和障礙性疾病的預(yù)防和控制具有十分重要的意義。病毒檢測的靈敏度越高,對病毒感染的早期檢測越精確,則對疫病的防治越重要。PRRSV病毒含量和病毒的動態(tài)變化對治療豬呼吸和障礙性疾病時藥物的選取,藥物劑量,藥物作用時間等條件具有重要的指導(dǎo)意義,對治療后的康復(fù)保健也具有指示作用。目前已有一些利用實時熒光定量PCR檢測PRRSV的報道。楊宗照等[10]建立了實時熒光定量PCR方法檢測高致病性PRRSV,結(jié)果顯示該方法可快速簡便地檢測HP-PRRSV。黃震等[11]建立了基于SYBR GreenⅠ染料技術(shù)實時熒光定量PCR方法檢測PRRSV,結(jié)果顯示該方法具有較好的重復(fù)性和特異性,檢測靈敏度達到13 copies/μL。但這些建立的方法使用SYBR Green染料,雖然在設(shè)計時更加簡便,但熒光染料能夠和任何dsDNA結(jié)合,因此它也能和二聚體等非特異性DNA結(jié)合,使實驗出現(xiàn)假陽性信號,降低了實驗的特異性。陶海靜等[12]建立了基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR檢測PRRSV方法,但其靈敏度相對較差。PRRSV感染后仍將在豬只特定位點持續(xù)低水平存在,主要存在于淋巴組織[13],對此階段的宿主進行PRRSV病原檢測就需要更高的靈敏性、特異性和準確性的方法。本實驗建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法檢測靈敏度可達5 copies/μL,能夠在PRRSV感染早期和晚期進行準確診斷檢測。

本研究對60份肺、脾以及58份血清樣本采用熒光定量PCR方法進行了檢測,并與普通PCR方法檢測結(jié)果進行比較分析,陽性率分別高達16.7%和24.1%。本研究建立的實時熒光定量PCR方法具有較高的檢測靈敏度,由于檢測陽性樣品均具有高的病毒滴度,兩種檢測方法在所檢測的樣本范圍內(nèi)符合率100%,但本試驗所建立的檢測方法不但可以對PRRSV定性檢測,還可以對PRRSV進行定量檢測,同時也免去了DNA電泳的步驟,更加方便省時,而在病毒含量低和大量臨床樣品檢測時具有更明顯的優(yōu)勢。所檢測血清樣本的陽性感染率與張志等[14]在2009年部分地區(qū)規(guī)模豬場全血多種病原監(jiān)測中PRRSV流行調(diào)查結(jié)果一致;組織樣品的感染率與徐麗華等[15]調(diào)查結(jié)果相比差異較大,表明在不同地區(qū)因管理水平和衛(wèi)生條件不同,感染率可相差很大。

本研究采用TaqMan探針技術(shù)成功建立了熒光定量PCR檢測PRRSV的方法,確定了該方法檢測的最佳條件,驗證了該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性.并成功應(yīng)用于臨床樣品的檢測。結(jié)果表明本研究建立的方法可有效應(yīng)用于對PRRSV的檢測,為藍耳病防治提供科學(xué)依據(jù),同時可用于疫苗效價評估和致病機理等方面的研究。

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(責(zé)任編輯：許惠兒)

Rapid Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus by Real-Time Fluorescence Quantitative PCR

WUHai-gang,RAOPin-bin,CAIYe,QUANYan-ping,JIANGYong-hou

(School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China)

The purpose of this study is to develop TaqMan-based real-time fluorescence quantitative PCR method which can detect rapidly porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV).Primers and TaqMan probe were designed in accordance with ORF7 conserved sequence of PRRSV.Based on conventional PCR,fluorescence quantitative PCR based on TaqMan probe was designed and optimized to detect PRRSV.The results show correlation coefficient of real-time fluorescence quantitative PCR based on TaqMan probe is greater than 99%,with amplification efficiency of 97%.It has a good linear relation.The method was used to detect porcine circovirus type 2 (PCV2),porcine parvovirus (PPV),pseudorabies virus (PRV),classical swine fever virus (CSFV) and Japanese encephalitis virus (JEV).The results were negative.This shows this method has favorable specificity.The sensitivity test indicates detection limit of this method is 5 copies/μL.58 serum and 60 tissue samples were tested with such method.14 positive serums and 10 positive tissues were detected.These results show real-time fluorescence quantitative PCR based on TaqMan probe owns good specificity,sensitivity and repeatability.It can provide more efficient technical platform for clinical detection of PRRSV.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus; TaqMan probe; real-time fluorescence quantitative PCR; detection

1673-3851 (2015) 02-0258-06

2014-05-20

浙江省自然科學(xué)基金項目(Y3090166);國家自然科學(xué)基金項目(31101831)

吳海港(1988-),男,浙江紹興人,碩士研究生,主要從事病毒分子診斷方面的研究。

姜永厚,E-mail:yonghoujiang@zstu.edu.cn

S852.659.6

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