免疫磁球捕獲-PCR檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的研究

鄧 奕,許迪莘,趙琳娜,楊 寅,*

(1.北京市科學(xué)器材公司,北京 100010;2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心,北京 100041)

免疫磁球捕獲-PCR檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的研究

鄧 奕1,許迪莘1,趙琳娜2,楊 寅1,*

(1.北京市科學(xué)器材公司,北京 100010;2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心,北京 100041)

對免疫磁球捕獲-PCR(IMS-PCR)檢測牛奶中金黃色葡萄球菌進行了初步研究。優(yōu)化了免疫磁球制備參數(shù),確定了金黃色葡萄球菌免疫磁球?qū)δ繕司慕Y(jié)合時間。研究結(jié)果顯示,當(dāng)純菌濃度為101～104CFU/mL水平時,金黃色葡萄球菌免疫磁球?qū)δ繕司牟东@率大于80%。通過對目標菌和非目標菌的檢測,IMS-PCR檢測方法顯示了很強的特異性;在純培養(yǎng)、無需增菌情況,IMS-PCR檢測方法檢測限為104CFU/mL;牛奶中的金黃色葡萄球菌經(jīng)磁分離后增菌2h用PCR檢測,可檢測出104CFU/mL的金黃色葡萄球菌。

免疫磁球捕獲,PCR,牛奶,金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,簡稱金葡菌)廣泛分布于自然界,在全世界范圍內(nèi),由金葡菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中占有較大比例[1-2],金葡菌產(chǎn)生的腸毒素是引起食物中毒的主要原因[3]。食品中金葡菌的檢測非常重要,是我國食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗常規(guī)檢測項目之一[4]。

傳統(tǒng)的檢測方法耗時長且靈敏度較低,免疫學(xué)方法的特異性和靈敏度受試劑純度影響很大。PCR 方法可以快速、靈敏的從食品中檢測金葡菌[5-6]。血漿凝固酶基因[7]、耐熱核酸酶基因[8]、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因[9],腸毒素編碼基因[10]是常見的檢測金黃色葡萄球菌的靶基因,核糖體RNA基因[11-12]也是良好的鑒定金黃色葡萄球菌的目標位點。

目前制約食品中致病菌檢測速度的一個主要問題是目標菌濃度較低,前增菌時間過長,可以通過對樣品的增菌液過濾實現(xiàn)目標物的富集以縮短增菌時間[13]。免疫磁分離方法(Immunomagnetic Separation,IMS)也可以很好的實現(xiàn)目標菌的富集,該方法將具有超順磁性的高分子微球與抗體結(jié)合制備免疫磁球,通過抗原抗體反應(yīng)選擇性地與目標物結(jié)合,使目標物與干擾物質(zhì)分離。免疫磁球?qū)ι锏亩拘暂^低,在分離檢測微生物方面有獨特的優(yōu)勢[14],被磁球捕獲的微生物可以直接培養(yǎng),或進行PCR、Elisa[15-16]等檢測,具有極強的應(yīng)用性[15,17]。

本研究中PCR所檢測的目的基因為aroA[18]。在前期工作基礎(chǔ)上[19],本研究優(yōu)化了金葡菌免疫磁球的制備等條件,可在8h之內(nèi)完成所有操作,利用免疫磁球富集及PCR 擴增來提高金葡菌的分子診斷技術(shù),為牛奶中金葡菌的快速篩查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌標準菌株(Staphylococcusaureus,ATCC 25923),鼠傷寒沙門氏菌標準菌株(Salmonellatyphimurium,ATCC 14028),福氏志賀氏菌標準菌株(Shigellaflexneri,ATCC 12022),單核細胞增生李斯特菌標準菌株(Listeriamonocytogenes,ATCC 15313),大腸桿菌O157∶H7標準菌株(EscherichiacoliO157∶H7) 北京市理化分析測試中心微生物室保存;粒徑為500nm超順磁性聚合物微球(MPB-d) 北京萬德高科技發(fā)展有限公司;金葡菌多克隆抗體 Meridian公司;Baird-Parker培養(yǎng)基基礎(chǔ)、亞碲酸鉀卵黃增菌液、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、TSA-YE培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂 均購于北京陸橋;PBS 緩沖液、牛血清白蛋白 Sigma 公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、D2000 DNA Marker 天根生化科技(北京)有限公司;Taq DNA聚合酶 Takara;實驗中用水為去離子水。

生物安全柜 BHC-1300ⅡA2,蘇州安泰科技技術(shù)有限公司;生化培養(yǎng)箱 SHP-150型,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;恒溫振蕩器 THZ-C,太倉市實驗設(shè)備廠;臺式離心機 Sigma 1-14型,德國;純水儀 Mili-Q MILLIPORE,美國;臺式天平 SHIMADZU uw620H,日本;自動高壓滅菌鍋 HIRAYAMA HG-80,日本;渦旋振蕩器 VORTEX-T SI,美國;PCR儀 Bio-Rad S1000,美國;凝膠電泳儀 DYY-6C,北京六一廠;水平瓊脂糖凝膠電泳槽 北京六一廠;凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad Gel Doc XR,美國;磁力架 廈門百維信生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫磁球捕獲體系的構(gòu)建及優(yōu)化 將40μL 5mg/mL的磁球用無菌去離子水清洗,懸浮于10μL的PBS(0.01mol/L,pH7.4,后面均相同)中;在磁球的PBS溶液中分別加入5、10、20、40μL的金葡菌多克隆抗體(2mg/mL)配制的PBS溶液(總體積為1mL),磁球與抗體溶液充分振蕩均勻,室溫下(25℃左右)以100r/min 振蕩2h,加入1.0mL PBS 清洗三遍,1% BSA封閉1h 后,同1mL待分離目標菌混合,室溫孵育60min,置于磁分離器中磁分離30min,移出上清液,用1mL PBS清洗磁球復(fù)合物三遍,并懸浮于1mL PBS中。取上清液及懸浮液200μL涂平板培養(yǎng)。平板計數(shù)評價免疫磁球富集效率,抗體的最適用量由最終的分離捕獲率決定。捕獲率(%)=(免疫磁球捕獲的細菌數(shù)/待分離細菌數(shù))×100。

將新鮮培養(yǎng)的金葡菌用PBS 10倍倍比稀釋,在含有40μg抗體的免疫磁球中加入1mL 3×102CFU/mL的菌液,室溫結(jié)合不同時間(5、10、20、30、60min);另外,取含有40μg抗體的免疫磁球分別加入稀釋(3×101～3×105CFU/mL)不同濃度的金黃色葡萄球菌溶液中,室溫結(jié)合30min,磁場下分離金葡菌-免疫磁球復(fù)合物,將分離的復(fù)合物洗滌3次后重懸于1mL PBS,取200μL涂布于培養(yǎng)基,恒溫37℃進行菌落培養(yǎng),平板計數(shù)評價免疫磁球捕獲率。

1.2.2 DNA提取及PCR檢測 經(jīng)磁分離得到的金葡菌-免疫磁球復(fù)合物作為富集的菌液按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明進行金葡菌DNA的提取,DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩０唤鹌暇贵w且不吸附致病菌的磁球作空白對照。提取107CFU/mL金葡菌的DNA為陽性對照。

金葡菌PCR檢測基因為aroA,該基因編碼5′-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶[18],上游引物5′-AAGGGCGAAATAGAAGTGCCGGGC-3′,下游引物 5′-CACAAGCAACTGCAAGCAT-3′,由北京市理化分析測試中心合成,擴增片段全長1153bp。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(MgCl2Free)2.5μL,2.5mmol/L dNTP 2μL,25mmol/L MgCl21.5μL,20μmol/L上、下游引物各0.5μL,5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL,去離子水ddH2O 7.8μL,DNA模板10μL,反應(yīng)總體積為25μL。擴增反應(yīng)在PCR儀上進行。反應(yīng)條件:95℃ 5min;95℃ 15s,55℃ 30s,72℃ 1min,循環(huán)35次;72℃ 5min。PCR產(chǎn)物用0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定,EB染色,于凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 IMS-PCR特異性 取裝有金葡菌抗體包被的免疫磁球5支,每管分別加入金葡菌和另外4種不對應(yīng)的致病菌菌液各1mL,室溫緩慢振蕩30min,洗滌三次,小心移出管內(nèi)液體,磁分離后用試劑盒提取DNA模板進行PCR反應(yīng),觀察是否有交叉反應(yīng)。

1.2.4 IMS-PCR靈敏性 將金葡菌菌液用PBS溶液10倍遞增稀釋,其中細菌濃度約為105、104、103、102、101CFU/mL。分別取1mL加入到裝有包被好金葡菌抗體免疫磁球的離心管內(nèi),捕獲后提取DNA進行PCR反應(yīng),檢驗其敏感性。

1.2.5 牛奶樣品實驗 將市售無菌牛奶分成900μL/份,金葡菌培養(yǎng)液按照10倍倍比稀釋,然后分別將各個稀釋度的菌液100μL加入到牛奶中混勻,使得到模擬樣品的細菌濃度為101～105CFU/mL。金葡菌免疫磁球捕獲的細菌經(jīng)培養(yǎng)2h后進行PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁球分離捕獲體系的優(yōu)化

為了快速高效的分離富集金葡菌,對免疫磁球的偶聯(lián)抗體量及免疫磁球與目標菌的結(jié)合時間進行了考察。制備免疫磁球所用抗體量會影響免疫磁球?qū)鹌暇牟东@率,見圖1。

圖1 不同抗體用量對金葡菌的捕獲率Fig.1 The effect of quantity of antibodies on the immunocapture of S. aureus in PBS

當(dāng)制備免疫磁球所用抗體為0.01mg,免疫磁球的捕獲率低于50%(目標菌濃度3×104CFU/mL),當(dāng)抗體濃度增加,捕獲率明顯升高。當(dāng)偶聯(lián)實驗中抗體為 0.02mg,同0.01mg比,捕獲率增加了20%;當(dāng)濃度高于或等于0.04mg時,捕獲率高于80%;當(dāng)抗體增加到0.08mg,在相同的菌濃度下,捕獲率并沒有顯著提高。綜合考慮性價比,在后續(xù)實驗中,用0.04mg 抗體包被磁球制備免疫磁球,用來捕獲1mL的待檢樣品。

如圖2所示,捕獲時間對于目標菌捕獲有重要影響。當(dāng)金葡菌免疫磁球同金葡菌的孵育時間從5min增加到10min,金葡菌的捕獲率從34.7%增長到 69.0%,當(dāng)孵育時間延長到30min,急劇增長到92.6%,孵育時間增加到60min時,免疫磁球?qū)δ繕司牟东@率較30min沒有明顯變化。因此,最適捕獲時間為30min。

圖2 不同孵育時間對金葡菌的捕獲率Fig.2 The effect of immunocapture time on the separation of S. aureus in PBS

在金葡菌免疫磁球?qū)Σ煌瑵舛饶繕司牟东@實驗中,當(dāng)目標菌濃度為104CFU/mL或低于104CFU/mL時,所制備的免疫磁球的捕獲率高于80%,當(dāng)目標菌濃度增加時,捕獲率降低(圖3)。

圖3 免疫磁球?qū)Σ煌瑵舛冉鹌暇牟东@率Fig.3 The capture efficiencies of the immunomagnetic beads for S. aureus in PBS at different bacterial concentration

2.2 IMS-PCR方法的特異性

為確定IMS-PCR檢測方法的特異性,對沙門氏菌、志賀氏菌及大腸桿菌等樣品菌株進行IMS富集并進行35個擴增循環(huán)。如圖4所示,在選定引物及55℃退火溫度下,只有金葡菌出現(xiàn)了陽性結(jié)果(1153bp),擴增出目的基因aroA的特異性條帶,而大腸桿菌O157∶H7、福氏志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌均未擴增出目的大小條帶,為陰性結(jié)果。說明在設(shè)定的研究條件下,免疫磁分離的前處理方法同PCR方法整合可以特異性的檢測金葡菌。

圖4 IMS-PCR特異性實驗結(jié)果Fig.4 Specificity tests results of IMS-PCR注:M:DNA marker;1～5大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌。

2.3 IMS-PCR方法的靈敏性

用IMS-PCR檢測不同濃度的金葡菌(101CFU/mL至105CFU/mL)，凝膠的結(jié)果如圖5。IMS-PCR方法的凝膠條帶很清楚,從圖中我們可以看到,當(dāng)金葡菌濃度為105CFU/mL時,可以清晰的看到擴增條帶,當(dāng)金葡菌濃度為103CFU/mL時,擴增條帶不清晰。結(jié)果證明用純培養(yǎng)物確定的IMS-PCR的檢測限為104CFU/mL。

圖5 IMS-PCR靈敏性實驗結(jié)果 Fig.5 Sensitivity tests results of IMS-PCR注:M:DNA marker;1～7分別為空白對照,陽性對照,金葡菌濃度105,104,103,102,101CFU/mL。

2.4 牛奶中金葡菌的檢測

用金葡菌免疫磁球分離捕獲牛奶中的金葡菌,可以實現(xiàn)金葡菌的特異性富集,減少干擾物質(zhì)的影響。取人工污染的混有不同濃度的金葡菌的牛奶1mL,用IMS-PCR 檢測牛奶中的金葡菌,結(jié)果見圖6。牛奶樣品經(jīng)過磁分離后,再經(jīng)過2h的增菌,用所建立的IMS-PCR 檢測技術(shù)可以檢測出牛奶中104CFU/mL的金葡菌。

圖6 牛奶樣品中金葡菌IMS-PCR 檢測結(jié)果Fig.6 S. aureus detection using IMS-PCR in milk sample注:M:DNA marker;1～7分別為空白對照,陽性對照,金葡菌濃度105,104,103,102,101CFU/mL。

3 結(jié)論與討論

用免疫磁分離結(jié)合PCR對目標物進行檢測的實際操作中,顯示該方法可以在8h內(nèi)完成,較國標方法更快速簡便,且具有不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能等多方面的特點。采用免疫磁球作為前處理步驟,可以富集濃縮金葡菌從而避免或減少漏檢,同時可去除樣品中抑制PCR擴增的成分。用免疫磁分離結(jié)合PCR對目標物進行檢測,可以顯著提高PCR反應(yīng)的靈敏性[20]。

本研究中確定了用以捕獲金葡菌的免疫磁球制備所需的抗體量為0.04mg,與前期研究中用熒光法標定所用磁球表面飽和抗體吸附值相近[19]。研究結(jié)果顯示隨著抗體濃度升高到0.08mg抗體量超過飽和抗體吸附值,過量的抗體無法吸附在磁球表面,對捕獲率的提升沒有影響。免疫磁球捕獲金葡菌在30min內(nèi)達到吸附平衡點,延長反應(yīng)時間對捕獲率沒有明顯影響。且免疫磁球?qū)?04CFU/mL以下濃度的目標菌的捕獲率大于80%,優(yōu)于鏈霉親和素磁珠制備的金葡菌免疫磁球[21]。免疫捕獲特異性檢測結(jié)果表明,包被金葡菌抗體的磁球只有與金葡菌反應(yīng)后才能擴增出目的條帶,而與其它4種菌反應(yīng)均無目的條帶出現(xiàn),因此該方法具有高度的特異性,完全適合食品致病菌的快速檢測。在本研究中,對IMS-PCR方法的靈敏性也進行了檢測。將純培養(yǎng)物培養(yǎng)的金葡菌菌液用PBS進行10 倍系列稀釋,當(dāng)細菌含量為104CFU/mL 時,仍能得到特異的PCR 擴增片段。人工污染金葡菌的牛奶檢測結(jié)果顯示:在牛奶中金葡菌的菌量為104CFU/mL 時,經(jīng)過磁分離后增菌2h,IMS-PCR方法即可檢出目標物,全部檢測在8h內(nèi)完成;若僅用PCR方法來檢測牛奶中的金葡菌,整個過程全部完成要24h[22]。經(jīng)免疫磁球富集后提高了金葡菌的檢測效率。

本研究所建立的方法在檢測牛奶中金葡菌時若不經(jīng)過增菌,檢測不到陽性信號,可能是牛奶中的復(fù)雜成分如脂肪及一些金屬離子對該實驗方法的敏感性有一定的影響[23]。

綜上所述,將免疫磁分離方法與PCR結(jié)合,可以綜合兩種方法的優(yōu)勢,避免常規(guī)PCR引起的假陽性現(xiàn)象及由于包被免疫磁球所用抗體特異性問題引起的交叉反應(yīng)。目前,從牛奶中檢測金葡菌僅限于人工染菌后建立樣品污染模型的實驗性階段,有待于進一步驗證實際樣品的檢測應(yīng)用,并使其標準化。

[1]Pelisser MR,Klein CS,Ascoli KR,et al. Occurrence ofStaphylococcusaureusand multiplex PCR detection of classic enterotoxin genes in cheese and meat products[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2009,40(1):145-148.

[2]Hennekinne JA,De Buyser ML,Dragacci S.Staphylococcusaureusand its food poisoning toxins:characterization and outbreak investigation[J]. FEMS Microbiology Reviews,2012,36(4):815-836.

[3]Krakauer T,Stiles BG. The staphylococcal enterotoxin(SE)family:SEB and siblings[J]. Virulence,2013,4(8):759-773.

[4]GB 4789.10-2010. 食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗[S].

[5]Graber HU,Casey MG,Naskova J,et al. Development of a highly sensitive and specific assay to detectStaphylococcusaureusin bovine mastitic milk[J]. Journal of Dairy Science,2007,90(10):4661-4669.

[6]Nakano S,Kobayashi T,Funabiki K,et al. PCR detection of Bacillus andStaphylococcusin various foods[J]. Journal of Food Protection,2004,67(6):1271-1277.

[7]Lawrence C,Cosseron M,Mimoz O,et al. Use of the coagulase gene typing method for detection of carriers of methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1996,37(4):687-696.

[8]Ercolini D,Blaiotta G,Fusco V,et al. PCR-based detection of enterotoxigenicStaphylococcusaureusin the early stages of raw milk cheese making[J]. Journal of Applied Microbiology,2004,96(5):1090-1096.

[9]Smeltzer MS,Gillaspy AF,Pratt FL Jr,et al. Prevalence and chromosomal map location ofStaphylococcusaureusadhesin genes[J]. Gene,1997,196(1-2):249-259.

[10]Ahmady M,Kazemi S. Detection of the enterotoxigenic genes(sei,sej)inStaphylococcusaureusisolates from bovine mastitis milk in the West Azerbaijan of Iran[J]. Comparative Clinical Pathology,2013,22(4):649-654.

[11]Amann RI,Ludwig W,Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews,1995,59(1):143-169.

[12]Phuektes P,Browning GF,Anderson G,et al. Multiplex polymerase chain reaction as a mastitis screening test forStaphylococcusaureus,Streptococcusagalactiae,Streptococcus

dysgalactiaeandStreptococcusuberis in bulk milk samples[J]. The Journal of Dairy Research,2003,70(2):149-155.

[13]Reidt U,Chauhan L,Müller G,et al. Reproducible filtration of bacteria with micromechanical filters[J]. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology,2008,16(4):337-350.

[14]Olsvik O,Popovic T,Skjerve E,et al. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology[J]. Clinical Microbiology Reviews,1994,7(1):43-54.

[15]Yang ZY,Shim WB,Kim KY,et al. Rapid detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples using immunomagnetic separation polymerase chain reaction(IMS-PCR)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemisty,2010,58(12):7135-7140.

[16]Málková K,Rauch P,Wyatt GM,et al. Combined Immunomagnetic Separation and Detection of Salmonella enteritidis in Food Samples[J]. Food and Agricultural Immunology,1998,10(3):271-280.

[17]Kumar S,Balakrishna K,Singh GP,et al. Rapid detection of Salmonella typhi in foods by combination of immunomagnetic separation and polymerase chain reaction[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(5):625-628.

[18]Marcos JY,Soriano AC,Salazar MS,et al. Rapid identification and typing ofStaphylococcusaureusby PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of thearoAgene[J]. Journal of Clinical Microbiology,1999,37(3):570-574.

[19]牛牧,杜美紅,鄧奕,等. 亞微米免疫磁球及其在細菌分離中的應(yīng)用[J]. 高等化學(xué)學(xué)報,2011,32(2):322-326.

[20]Coklin T,Farber JM,Parrington LJ,et al. Immunomagnetic separation significantly improves the sensitivity of polymerase chain reaction in detecting Giardia Duodenalis and Cryptosporidium spp. in dairy cattle[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2011,23(2):260-267.

[21]王程程,趙玲,李敏通,等. 基于免疫磁珠快速分離金黃色葡萄球菌的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(9):175-182.

[22]田靜,計融,楊軍,等. PCR方法快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌[J]. 衛(wèi)生研究,2007,36(2):183-186.

[23]Khare S,Ficht TA,Santos RL,et al. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in bovine milk and feces by a combination of immunomagnetic bead separation-conventional PCR and real-time PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology,2004,42(3):1075-1081.

Immunomagnetic separation combined with polymerase chain reaction for the detection ofStaphylococcusaureusin milk

DENG Yi1,XU Di-xin1,ZHAO Lin-na2,YANG Yin1,*

(1.Beijing Scientific Instruments and Materials Corporation,Beijing 100010,China;2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment,Beijing 100041,China)

The present study investigated the use of immunomagnetic separation(IMS)capture as an additional concentration step before PCR in the detection and identification ofStaphylococcusaureus(S.aureus)from milk. The optimum technological parameters of the IMS system and the coupling time of immunocapture reactions were investigated and evaluated. The capture efficiencies of the immunomagnetic beads were above 80% forS.aureusin PBS at a bacterial concentration of 101～104CFU/mL.S.aureuscould be detected in samples that were otherwise negative by IMS-PCR. The IMS-PCR method showed a detection threshold corresponding to 104CFU/mL inS.aureus-spiked PBS. In the case ofS.aureus-spiked milk,the minimum value of detection was 104CFU/mL after 2h enrichment.

Immunomagnetic separation;PCR;milk;Staphylococcusaureus

2014-05-27

鄧奕(1980-),女,博士,副研究員,研究方向:食品致病微生物檢測。

*通訊作者:楊寅(1980-),男,博士,副研究員,研究方向:材料學(xué)。

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目(2012D002022000001)。

TS207.4

A

1002-0306(2015)07-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.055