嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱β-半乳糖苷酶功能位點的累積進化研究

董藝凝,陳海琴,張 灝,陳 衛(wèi)

(1.滁州學院生物與食品工程學院,安徽滁州 239000;2.江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱β-半乳糖苷酶功能位點的累積進化研究

董藝凝1,陳海琴2,*,張 灝2,陳 衛(wèi)2

(1.滁州學院生物與食品工程學院,安徽滁州 239000;2.江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

針對嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB底物結合位點構建突變體,研究底物結合位點累積突變的功能進化及水解活性的變化規(guī)律。實驗結果表明:Y272A與E351R的累積突變體比酶活為野生型酶的3.67倍,為單點突變體Y272A的2倍;Y272A/E351R突變體的Km值增大,其對乳糖的親和力下降,但由于Kcat值增大,使累積突變體Y272A/E351R催化效率提高為野生型酶催化效率的7.8倍。本研究結果表明底物結合位點間的累積突變可改變底物親和性,并對水解催化活性進化起到正向促進作用。

β-半乳糖苷酶,嗜熱脂肪芽孢桿菌,累積進化,功能位點

β-半乳糖苷酶(β-d-galactoside galactohydrolase,EC 3.2.1.23)可以水解β-1,4-糖苷鍵,乳品工業(yè)用其水解乳糖生產低乳糖奶,以及利用β-半乳糖苷酶轉糖苷活性合成低聚半乳糖(GOS)。嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶BgaB屬于GH42家族,該家族β-半乳糖苷酶具有耐熱、耐鹽、耐酸以及耐堿等催化特性,但其對底物乳糖的利用效率普遍較低。因此,針對嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶BgaB功能進化及氨基酸位點的研究,可更好的改造β-半乳糖苷酶在特殊生產環(huán)境下的適應性。

自然界在進化過程將有益突變保留并累積以強化蛋白質功能[1-2]。人們在實驗室環(huán)境下模擬自然進化過程,通過采用蛋白質或基因工程技術,包括易錯PCR、定點突變以及點飽和突變等基因擴增技術,對酶分子進行功能改造。在獲得功能優(yōu)化的單點突變體基礎上,進行不同功能氨基酸位點間的多點突變,可以使蛋白質功能獲得進一步改善及“累積”[3-5]。如Cervelli M等[6],通過對活性口袋中底物結合位點的累積突變(E216L/S218A 和E216T/S218A)使spermine oxidase進化獲得N1-acetylspermine oxidase activity。柯濤等[7]利用重疊延伸法對嗜熱球菌Thermococcussp.的高溫酸性α-淀粉酶基因BD5088進行體外A154C/G155C雙點定點突變,酶學性質分析表明,突變淀粉酶拓寬了反應pH范圍,尤其是酸性條件下提高更為顯著。在前期研究中,筆者對耐熱β-半乳糖苷酶BgaB底物結合位點進行了預測及功能改造,并獲得了功能進化的單點突變體[8]。為了探索這些位點間協同進化規(guī)律,底物親和性變化特點,進而開展了本項研究,探討β-半乳糖苷酶功能氨基酸位點間累積進行對酶功能的影響。

表2 定點突變引物核酸序列

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒Escherichiacoli(E.coli)JM109(recA1,supE44,endA1,hsdR17,gyrA96,relA1,thi,([lac-proAB]F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]),DH5α(supE44ΔlacU169hsdR17(Φ80lacZΔM15)RecA1endA1gyrA96thi-1relA1);質粒載體pKK223-3均由江南大學食品生物技術中心菌種庫(Culture Collection of Food Microorganisms,Jiangnan university CCFM)提供。

1.1.2 主要試劑及儀器設備 氨芐青霉素(Amp) 購自上海生工;限制性內切酶,T4 DNA連接酶,Taq DNA聚合酶 購自Takara公司;KOD plus高保真DNA聚合酶 購自Toyobo公司;DpnI 購自Fermentas公司;DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒 購自北京索萊寶科技有限公司;PCR產物純化試劑盒 購自北京天根生化科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒 購自北京莊盟生物基因科技有限公司;葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;鎳親和柱(Ni-Chelaing Column) Qingen公司。

GS00001PCR儀 英國G-STROM公司;5415R/5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Power pac核酸電泳儀 Bio-Rad Laboratories;Basic 041BR蛋白質電泳儀 Bio-Rad Laboratories;Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad Laboratories;SpectraMax M5/M5e微孔板檢測系統(tǒng) Molecular Devices;UV-2100可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;MK3酶標儀 Thermo公司;VCX500超聲波破碎儀 SONICS&MATERIALS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 累積突變體設計 本文在已有研究基礎上,將BgaB的不同功能進化的單點突變體進行突變累積研究,以進一步探討及功能變化及作用機制。累積突變設計如表1所示。

表1 累積突變實驗設計表

1.2.2 累積突變體的構建 以構建質粒pKK223-3-bgaB的單點突變體(R109W,E351R)為模板,采用快速全質粒擴增突變法(QuickChange? site-directed mutagenesis protocol)針對選擇位點引入累積位點突變體。三位點累積突變以構建雙點突變體為模板。引物設計如表2。

1.2.3 野生型及突變酶的表達及純化 以JM109作為宿主,pKK223-3作為表達載體對野生型及突變酶進行誘導表達。菌體破壁后將破胞液55℃熱處理30min去除不耐熱的雜蛋白后,12000r/min離心20min收集上清,即得粗酶液。經鎳親和柱(Ni-Chelating Column)純化,然后用50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)透析除去咪唑,再用聚乙二醇包埋濃縮制得純化酶蛋白樣品。

1.2.4 β-半乳糖苷酶活性測定 按中性乳糖酶酶活檢測方法(Gist-Bracades法)[9]。以鄰硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷(oNPG)為底物,一個中性乳糖酶單位定義為:在pH6.5條件下,每分鐘水解產生1μmol的oNP所需的酶量為一個中性乳糖酶活單位(NLU或U)。對嗜熱脂肪芽孢桿菌源酶及其重組酶,反應溫度定為55℃。

1.2.5 最適反應pH 配制不同pH的磷酸鹽緩沖液,并用相應的緩沖液溶解底物oNPG,在最適反應溫度下按中性乳糖酶酶活檢測方法(Gist-Bracades法)測定相對酶活。

1.2.6 動力學常數測定 配制oNPG濃度0.1～15mmol/L,在50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),55℃條件下測定酶反應初速度。采用Lineweaver-Burk法對1/V-1/[S]作圖,根據兩軸上的截距求得Km值(x軸截距負倒數)與Vmax(y軸截距倒數),再由Vmax=kcat*[E]計算求出kcat;半乳糖抑制實驗為在酶活測定反應體系中加入不同濃度半乳糖(0～200mmol/L),以Linweaver-Burk 作圖法求Ki。

1.2.7 β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性測定 將酶溶解于20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中,不同溫度下保溫一定時間后,取出迅速冷卻,室溫平衡后按1.2.4方法測定酶活。半衰期的測定方法為將野生型及突變體純化酶置于70℃水浴保溫,每間隔5min取樣迅速置冰水中冷卻。在最適反應溫度條件下測定酶活。以未經熱處理,最適反應溫度下測得酶活100%,不同時間熱處理后保留酶活對時間作圖,求得野生型及突變體酶半衰期。

1.2.8 β-半乳糖苷酶BgaB結構模擬分子 結構模擬采用同源建模法,以同源家族晶體結構A4-β-Gal為模板(PDB:1kwk),采用在線建模服務器(http://swissmodel.expasy.org/)構建BgaB分子模擬結構。利用AutoDock軟件對底物結合模式進行預測。

2 結果與分析

2.1 功能位點的預測與分析

耐熱β-半乳糖苷酶以其良好的熱穩(wěn)定性,及適宜高溫度條件下乳糖水解的特性,使之具有常溫乳糖酶所不具有的催化優(yōu)越性。但是由于其對乳糖的水解活性較低,限制了其在食品工業(yè)中的應用。在之前的研究中,通過同源序列比對預測了參與耐熱β-半乳糖苷酶BgaB底物結合的位點,發(fā)現可能參與底物結合的位點包括Arg109,Asn147,Try272,Trp311,Phe341,Glu351和His354(如圖1)。并針對所有位點構建了飽和突變體文庫,通過突變體庫的篩選,獲得了乳糖水解活性提高的單點突變體E351R,Y272A和R109W。

圖1 β-半乳糖苷酶BgaB與乳糖和半乳糖分子結合位點模型Fig.1 The binding modes of the lactose and galactose in the active site of BgaB注:A-乳糖結合位點示意圖;B-半乳糖結合位點示意圖。

2.2 累積突變設計及粗酶活分析

以本研究前期工作已經構建的單點突變酶基因為模板,采用全質粒擴增方法在酶基因序列上引入突變,所有累積突變體擴增得到大小為5000bp左右的條帶(如圖2),符合全質粒擴增產物大小。

圖2 耐熱β-半乳糖苷酶BgaB累積突變體全質粒擴增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of thermostable β-galactosidase BgaB cumulative mutagenesis by plasmid amplification注:1-pKK223-3-bgaB;2-R109W/E351R;3-Y272A/E351R;4-R109W/Y272A;5-R109W/Y272A/E351R. M-DNA Marker。

96孔板粗酶活比較結果如圖3所示,相對于野生型酶活性提高的突變有Y272A/E351R。但是其中R109W/Y272A和R109W/E351R活性相對野生型酶及單點突變體,其反應體系吸光值均有不同程度下降,表明其酶活下降,而累積突變體R109W/Y272A/E351R未檢測到405nm處吸光值。由于采用酶反應體系吸光值靈敏度受到表達量影響較大,故對突變體酶進行純化分析。

圖3 突變酶與野生型酶粗酶活比較Fig.3 Comparative of the crude enzyme activity of mutants and wild-type enzymes

2.3 累積突變體水解活性分析

為了研究累積突變體酶的催化特性,首先對累積突變體R109W/Y272A,R109W/E351R,Y272A/E351R和R109W/Y272A/E351R進行蛋白純化(如圖4)。突變體酶與野生型相比,蛋白分子量大小相同均為70ku。分別對純化突變體酶進行比酶活、最適pH及酶反應動力學測定。

圖4 野生型及累積突變體酶SDS-PAGE分析Fig.4 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)analysis of the purified wild-type and mutant enzymes.注:1-野生型酶;2-R109W/Y272A;3-R109W/E351R;4-Y272A/E351R;5-R109W/Y272A/E351R；M:蛋白質標準marker。

2.3.1 突變體比酶活變化分析 累積突變體比酶活分析結果如表3所示,R109,Y272和E351三個位點累積突變體中,雙點突變體Y272A/E351R比酶活最高,為野生型酶比酶活的3.67倍,分別是單點突變體Y272A的2.1倍,是R109W突變體比酶活的3倍。雙點突變R109W/Y272A和R109W/E351R的比酶活小于單點突變體,并下降為野生型酶比酶活的76%和68%。其中,單點突變體E351R是經定向進化篩選所得比酶活提高最多的突變體,其比酶活為野生型的3.5倍。其次是Y272A突變體比酶活為野生型酶的1.8倍。R109W是Arg109位點突變體庫中篩選得到的最優(yōu)突變,其比酶活比野生型提高了1.2倍。比酶活比較結果顯示,雙位點累積突變體酶活相對野生型及單位點突變體酶活變化呈提高和下降兩種變化,但R109W/Y272A/E351R累積突變體酶失活。

表3 野生型及突變酶比酶活分析

注:N.D.-未檢測到活性。

2.3.2 最適pH的變化 雙點突變體最適作用pH與野生型酶及對應單點突變體比較結果如圖5所示。突變體R109W/E351R最適pH為7.5,與單點突變體E351R相同,二者最適作用pH條件均相對野生型酶(pH7.0)及單點突變體R109W(pH 7.25)向堿性條件偏移(圖5-A);雙點突變R109W/Y272A相對野生型酶最適pH向酸性條件發(fā)生偏移,但與單點突變體Y272A最適pH相同均為6.75(圖5-B)。雙點突變體Y272A/E351R的最適pH介于單點突變Y272A(pH6.75)和單點突變體E351R(pH7.5)之間,相對野生型最適pH向堿性條件偏移(圖5-C)。

通過與GH42家族A4-β-Gal晶體結構比較分析,發(fā)現BgaB的底物結合位點Arg109和Glu351位點均位于BgaB的活性口袋內,分別參與底物半乳糖基C3,C4結合(如圖6)。Tyr272位點雖然未在結構模擬中分析到它的結合能,即該位點沒有直接通過氫鍵作用參與底物結合,在同家族酶A4-(-gal結構中,與其對應的Tyr266和被認為具有調控催化氨基酸Glu312位點pka的功能[10]。本項研究中Tyr272位點的突變也改變了BgaB的最適作用pH條件,表明Tyr272位點(以BgaB氨基酸序列編碼)可能在GH42家族糖苷水解酶中起到調控pH的作用,因此在催化過程中不可缺失。Arg109位點及Glu351氨基酸位點的改造及累積突變對pH的影響機制還有待進一步探討。

圖5 野生型、單點突變體及累積突變體最適pHFig.5 The optimum pH of the willd-type,single mutation and double mutation注:A-R109、E351雙點突變體最適pH;B-R109、Y272雙點突變體的最適pH;C-Y272、E351雙點突變體最適pH。

圖6 耐熱β-半乳糖苷酶BgaB分子結構及底物結合位點模擬Fig.6 Homology model of the thermostable β-galactosidase BgaB and substrate binding注:A-耐熱β-半乳糖苷酶BgaB與底物結合示意圖;B-參與半乳糖分子結合的氨基酸位點示意圖。

表4 野生型及突變酶水解oNPG和乳糖反應動力學參數

2.3.3 酶反應動力學參數分析 累積突變體的動力學參數測定結果及與野生型、單點突變體的比較如表4。以oNPG作為底物時,累積突變體R109W/E351R,R109W/Y272A和Y272A/E351R與野生型酶相比km值均增大。表明雙點突變對底物的親和力有所下降,但累積突變體轉換常數kcat相對野生型變大。Y272A/E351R的催化效率(kcat/Km)高于單點突變體酶Y272A,E351R及野生型酶,是野生型酶催化效率的5倍。由此可以看出,雙點突變Y272A/E351R的底物親和力有所下降,但kcat的提高最終促進催化效率的提高增大。Arg109位點與Glu351位點的累積突變沒有進一步提高催化效率,R109W/E351R和R109W/Y272A的催化效率相對野生型及單點突變均變小,這可能主要是由于底物親和力顯著降低造成的。

以乳糖為底物的動力學測定結果表明,Y272A/E351R相對野生型km值變大,對乳糖的親和力下降。但由于kcat值同時增大,使累積突變體Y272A/E351R催化效率相對野生型和單點突變體均有所提高,為野生型酶催化效率的7.8倍。這表明Y272A/E351R對乳糖和oNPG為底物的動力學參數變化規(guī)律一致,累積突變可以使催化效率相對單點突變獲得提高。累積突變體R109W/E351R以乳糖和oNPG為底物的動力學反應相對野生型的變化規(guī)律有所不同。雖然,R109W/E351R以oNPG為底物的催化效率相對野生型及單點突變均有所下降,但以乳糖為底物時,R109W/E351R相對野生型酶其Km值變小、kcat值增加。表明R109W/E351R突變體對乳糖的親和力增加,反應速率增大,且催化效率提高為野生型酶的2倍。累積突變體R109W/E351R對不同底物催化效率發(fā)生改變的現象也表明,累積突變可能影響了底物的選擇性。

2.4 累積突變體穩(wěn)定性分析

對雙點突變的熱穩(wěn)定性研究結果,如圖7所示。70℃下雙點突變體與野生型酶的熱失活進程曲線相似,表明影響活性的Arg109,Try272及Glu351位點間累積突變后,未改變酶的穩(wěn)定特性。從單點突變體與雙點突變的最適作用溫度比較還可以發(fā)現,野生型酶及雙點突變體最適作用溫度均為55℃(如圖8)。其中,Y272A/E351R突變體酶活在不同溫度條件下,比酶活均高于野生型酶。綜合以上研究結果可知,R109W/E351R,R109W/Y272A以及Y272A/E351R突變體均未改變酶的熱穩(wěn)定性。該結果表明BgaB 功能位點間的累積突變不影響酶的穩(wěn)定特性及最適作用溫度。

圖7 野生型及突變體酶熱失活過程(70℃)Fig.7 Thermal inactivation curves of wild-type and mutants(70℃)

圖8 野生型及突變酶比酶活的溫度變化圖Fig.8 Specific activity of wild-type and mutants over temperature

3 結論

通過對突變體比酶活及酶反應動力學結果分析表明,底物結合位點間的累積突變可以導致酶對底物親和力發(fā)生變化,進而影響了酶的催化活性。這一研究結果說明,底物結合模式是影響底物親和特異性及催化特性關鍵因素。本研究中,底物結合位點間的累積進化,可對酶的催化活性產生兩種相反的改變,包括比酶活提高和比酶活的降低。但累積突變對于酶的催化活性影響產生負作用的可能性要大于其對酶功能的正向促進作用,且三點累積突變體可導致酶失活。說明功能位點耐受突變的程度有限,這一結果符合自然進化規(guī)律,即酶的催化位點都具有嚴格的保守性[11-12]。其原因可能在于保守氨基酸位點的突變及累積突變所帶來的功能改變大多對于酶的催化特性而言是不利的[13]。但同時,對功能位點的改造可以實現酶的快速功能進化。參與底物結合位點間作用關系的揭示也將有助于蛋白質功能的改造和催化機制的完善。本研究結果也同時表明了,對底物結合位點間位點的累積突變,是一種提高β-半乳糖苷酶功能進化的高效策略。但氨基酸位點間的相互影響及作用關系十分復雜,對這種復雜變化的結構基礎還有待進一步深入探討。

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Coevolutionary study on the functionary amino acid residues ofGeobacillusstearothermophilusthermostable β-Galactosidase BgaB

DONG Yi-ning1,CHEN Hai-qin2,*,ZHANG Hao2,CHEN Wei2

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Chuzhou University,Chuzhou 239000,China;2. Shool of Food Science and Technology,State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To study the coevolutionary of the functional residues and the variation of hydrolysis activity,the substrates binding residues simultaneous mutations ofGeobacillusstearothermophilusthermostable β-galactosidase were constructed. The results showed that the Y272A/E351R simultaneous mutant let a 3.67-fold increase in specific activity over the wild type enzyme and give a 2-fold increase over the single site mutation Y272A. Increased Km value of Y272A/E351R mutant occurred with decreased affinity of lactose binding,while the mutant increased the catalytic efficiency of the wild type enzyme by 7.8-fold. This study revealed that the simultaneous evolution of the substrate binding residues had its advantage on substrate affinity,and was favorable to the evolution of catalytic activity.

β-galactosidase;Geobacillusstearothermophilus;simultaneous evolution;functional residues

2014-06-16

董藝凝(1980-)，女，博士，研究方向：酶的功能進化。

*通訊作者:陳海琴(1978-)，女，博士，教授，研究方向：食品微生物功能發(fā)掘與利用。

國家青年科學基金項目(31301523)；國家自然科學基金項目(31171636)；十二五國家“863”計劃(2011AA100905)；安徽高校省級科學研究項目(KJ2013B187)；滁州學院科研啟動基金資助項目(2012qd14)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0148-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.023