共培養(yǎng)體系間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)同源內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和血管形成的影響

馮文磊，張 猛，徐芳潔，王艷杰，陳雪玲，吳向未

0 引 言

心肌梗死后心肌細(xì)胞將不可逆丟失，被纖維瘢痕組織取代，最終導(dǎo)致心力衰竭。移植細(xì)胞在心肌損傷部位存活率低，對(duì)心臟功能的改善有限［1］。骨髓中至少存在3 種干/祖細(xì)胞系統(tǒng):間充質(zhì)干細(xì)胞系統(tǒng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞系統(tǒng)和造血干細(xì)胞系統(tǒng)，它們生物學(xué)行為密切耦聯(lián)［2］。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚層來(lái)源的具有高度自我更新增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞［3］，在特定條件下能分化為骨、軟骨、脂肪、內(nèi)皮和心肌等多種組織細(xì)胞［4－8］。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類(lèi)能高度增殖、特異分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的祖細(xì)胞［9］。已有研究證實(shí)，MSCs 能分泌包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)等在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子在各種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的功能和活性［10－12］。Transwell 小室是一種特殊的共培養(yǎng)工具，細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)通過(guò)微孔可以相互交通實(shí)現(xiàn)非接觸共培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)分離培養(yǎng)鑒定骨髓源MSCs 和EPCs，并在Transwell 小室共培養(yǎng)以研究MSCs 對(duì)EPCs 增殖和血管形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔型C57B/L6 小鼠，4 ～6 周齡，20 ～22 g，雌雄不拘，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(新)2011-0001，小鼠于光照良好、溫度22 ℃、濕度50%～70%環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、飲食。通風(fēng)和濕度適宜的清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食飲水。胎牛血清(Gilbco，美國(guó))，LG-DMEM 培養(yǎng)基(Gilbco，美國(guó))，PBS(Hy-Clone，美國(guó))，EGM2-MV 培養(yǎng)基(Lonza，瑞士)，青霉素、鏈霉素(Solarbio，中國(guó))，2.5 g/L 胰蛋白酶(HyClone，美國(guó))，人纖連蛋白(BD，美國(guó))，MTT(Sigma，美國(guó))，二甲基亞砜(Sigma，美國(guó))，多聚甲醛固定液(賽馳生物，中國(guó))，成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及茜素紅、阿利新藍(lán)、油紅O 染料(Cyagen Biosciences，美國(guó))，基質(zhì)膠(BD Biosciences，美國(guó))，抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE、CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC 及抗IgG 同型對(duì)照(eBioscience，美國(guó))，EdU 試劑盒(銳博，中國(guó))，96 孔、24 孔Transwell 小室(Coning，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Coning，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))，熒光倒置相差顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(Leica，德國(guó))，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM510，德國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 MSCs 和EPCs 的分離培養(yǎng) 取小鼠1 只，脫頸處死，75%乙醇浸泡5 min，分離小鼠下肢，剔除股骨與脛骨肌肉組織與筋膜，置于PBS 中。剪去長(zhǎng)骨兩端骨骺，以含10%FBS 的LG-DMEM 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至發(fā)白，沖出骨髓于60 mm 培養(yǎng)皿中，吹打均勻放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h 后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，換新鮮含10%FBS 的LG-DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)MSCs，同時(shí)收集離心未貼壁細(xì)胞，以EGM-2MV 培養(yǎng)基在預(yù)先包被人纖連蛋白的60 mm 培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后吸除舊培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞換新鮮EGM-2MV 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)來(lái)擴(kuò)增EPCs。MSCs 和EPCs均為48 h 換液1 次。原代培養(yǎng)的MSCs 與EPCs 至80%～90%融合時(shí)皆按1∶2 傳代。

1.2.2 MSCs 和EPCs 的表面標(biāo)記物檢測(cè) 分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3 代MSCs 和EPCs，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，2.5 g/L 胰蛋白酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 清洗2 遍，PBS 重懸細(xì)胞，吹打均勻調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，分裝每管100 μL，分別加入直接熒光標(biāo)記MSCs 抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE 和直接熒光標(biāo)記EPCs 抗小鼠CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC。分別以IgG-FITC、IgG-APC、IgGPerCP-Cy5.5、IgG-PE 為同型對(duì)照，不標(biāo)記細(xì)胞為空白對(duì)照。4 ℃孵育1 h，每15 min 輕搖1 次。PBS 洗除未標(biāo)記上的抗體，10 g/L 多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記物表達(dá)情況。

1.2.3 MSCs 和EPCs 的功能鑒定 ①M(fèi)SCs 成骨誘導(dǎo)分化:第2 代細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度以3×104個(gè)/cm2在6 孔板用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3 周，茜草色素紅染色，鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。②MSCs 成軟骨誘導(dǎo)分化:第2 代細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度3×104個(gè)/cm2在，用成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，阿利新藍(lán)染色，鏡下觀察。③MSCs 成脂誘導(dǎo)分化:第2 代細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度3×104個(gè)/cm2，培養(yǎng)至100%鋪滿(mǎn)，成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，更換為L(zhǎng)G-DMEM 培養(yǎng)基，24 h后再次更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，循環(huán)3 ～5 次，最后LGDMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，油紅O 染色，鏡下觀察脂滴形成情況。④EPCs 的體外成血管能力檢測(cè):在96孔板的每孔中鋪50 μL 基質(zhì)膠，消化第3 代EPCs，EGM-2MV 培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于基質(zhì)膠上，輕輕拍打，使細(xì)胞接種均勻。倒置顯微鏡觀察小管形成情況。

1.2.4 MTT 比色法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs 增殖影響 第2 代EPCs 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，用含5%胎牛血清的EGM-2MV 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/cm2接種于96 孔Transwell 培養(yǎng)板內(nèi)下室，每孔EGM-2MV 培養(yǎng)基加至250 μL，共接種48 孔。第2 代MSCs 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，用含5%胎牛血清的EGM-2MV 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/cm2接種于96 孔Transwell培養(yǎng)板上室，然后每小室EGM-2MV 培養(yǎng)基加至80 μL，共接種24 孔。以上室接種MSCs 下室接種EPCs 為實(shí)驗(yàn)組，以?xún)H下室接種EPCs 為對(duì)照組。培養(yǎng)24 h 后，每組按順序各取3 孔去掉Transwell 小室，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h 后棄去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，震蕩儀低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm 波長(zhǎng)吸光度值(A值)。連續(xù)測(cè)定8 d。各組設(shè)與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。

1.2.5 EDU 熒光標(biāo)記法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs DNA 合成的影響 第2 代EPCs 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min離心5 min，用含5%胎牛血清的EGM-2MV 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/cm2接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24 孔Transwell 培養(yǎng)板內(nèi)下室，每孔EGM-2MV 培養(yǎng)基加至600 μL，共接種6 孔。第2 代MSCs 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，用含5%胎牛血清的EGM-2MV 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/cm2接種于24 孔Transwell 培養(yǎng)板上室，然后每小室EGM-2MV 培養(yǎng)基加至100 μL，共接種3 孔。培養(yǎng)72 h 后吸棄舊培養(yǎng)基，加現(xiàn)配50 μmol/L EdU培養(yǎng)基500 μL，孵育4 h。取出蓋玻片，嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、脫色、透膜、Apollo 染色及DNA 染色。激光共聚焦顯微鏡觀察鏡下熒光染色情況并選取5 個(gè)視野(中央、3、6、9、12 點(diǎn)位置)拍照，最后用Aim Image Examiner 軟件分析細(xì)胞核染色重合的面積比例。

1.2.6 體外成血管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs對(duì)EPCs成血管影響 第2 代EPCs 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min離心5 min，用含5%胎牛血清的EGM-2MV 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/cm2接種于預(yù)先鋪有250 μL 基質(zhì)膠的24 孔Transwell 培養(yǎng)板內(nèi)下室，每小室EGM-2MV 培養(yǎng)基加至600 μL，共接種6 孔。第2 代MSCs 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3 ～5 min，以離心半徑14 cm、1000 r/min 離心5 min，用含5%胎牛血清的EGM-2MV 培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/cm2接種于24 孔Transwell 培養(yǎng)板上室，每小室EGM-2MV 培養(yǎng)基加至100 μL，共接種3 孔。10 h后移去Transwell 小室，倒置顯微鏡觀察小管形成情況并選取5 個(gè)視野(中央、3、6、9、12 點(diǎn)位置)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次。組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs 和EPCs 細(xì)胞形態(tài)的觀察 MSCs 于48 h內(nèi)貼壁，細(xì)胞形態(tài)不均一，以成纖維樣細(xì)胞為主，4 d 可見(jiàn)集落形成，細(xì)胞沿集落周邊呈放射形生長(zhǎng)，8 ～10 d 鋪滿(mǎn)，以紡錘形細(xì)胞為主，經(jīng)傳代培養(yǎng)后形態(tài)漸趨均一呈“漩渦”狀。所收集上清液中EPCs 48 h 后貼壁，伸展成長(zhǎng)梭形，4 d 左右有細(xì)胞集落形成，中央為圓形細(xì)胞群，周邊有梭形細(xì)胞放射形生長(zhǎng)，10 ～12 d 細(xì)胞可達(dá)到80%～90%融合，晚期呈“鋪路石”狀。見(jiàn)圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs 和EPCs 的表面標(biāo)記物表達(dá) 結(jié)果顯示第3 代MSCs 高表達(dá)Sca-1 和CD29，陽(yáng)性率分別為(97.30±0.85)%和(98.47±1.57)%;而低表達(dá)CD45 和CD11b，陽(yáng)性率分別為(1.98±0.23)%和(1.42±0.39)%，符合MSCs 特性。第3 代EPCs 均高表達(dá)CD34、CD133 和VEGFR2，陽(yáng)性率分別為(90.72±1.43)%、(90.02±2.21)%和(91.67±1.65)%，符合EPCs 特性。見(jiàn)圖2。

2.3 MSCs 和EPCs 的功能鑒定結(jié)果 第3 代MSCs 可誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞:經(jīng)成骨誘導(dǎo)后形態(tài)由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，誘導(dǎo)14 d 時(shí)可見(jiàn)散在分布小褐色結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)21 d 后結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜草色素紅染色呈紅色。第3 代MSCs 可誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞:經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化不大，誘導(dǎo)21 d 后行阿利新藍(lán)染色，鏡下觀察可見(jiàn)誘導(dǎo)分化形成的軟骨細(xì)胞胞被染成淺藍(lán)色。第3 代MSCs 可誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞:細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞中有小脂滴形成，誘導(dǎo)21 d 后融合成大脂滴，經(jīng)油紅O 染色，脂滴被染成亮紅色。第3 代EPCs 體外形成血管腔樣結(jié)構(gòu):2 ～4 h后細(xì)胞變形拉長(zhǎng)，6 ～8 h 細(xì)胞遷移聚集，首尾相接，形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，10 ～12 h 達(dá)到頂峰。見(jiàn)圖3。

2.4 MTT 比色法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs 增殖影響 實(shí)驗(yàn)組24、48 h A492值均較對(duì)照組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);實(shí)驗(yàn)組第3－8 天A492值均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 顯微鏡下觀察MSCs 和EPCs 形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果Figure 1 Morphological characteristics of MSCs and EPCs

圖2 MSCs 和EPCs 的表面標(biāo)記物陽(yáng)性率流式檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Cellular surface antigens on MSCs and EPCs detected by FCM

圖3 MSCs 成骨成軟骨成脂誘導(dǎo)分化和EPCs 成血管功能鑒定結(jié)果Figure 3 Differentiation of MSCs into osteoblasts，chondrocytes and adipocytes and angiogenesis of EPCs under the light microscope

表1 MTT 比色法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs 增殖影響，n=3)Table 1 Trained MSCs effects on EPCs proliferation defermined by MTT，n=3)

表1 MTT 比色法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs 增殖影響，n=3)Table 1 Trained MSCs effects on EPCs proliferation defermined by MTT，n=3)

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天不 同時(shí)間A第492 5值 天 第6 天 第7 天 第8天對(duì)實(shí)照驗(yàn)組組 00..22 34 69±±00..00 3206 00..22 4599±±00..00 22 69 00..3462 24±±00..00 32 20 * 00..4555 93±±00..00 23 95 * 00..5675 62±±00..00 34 91 * 00..6754 59±±00..00 42 29 * 00..6767 52±±00..00 33 31 * 00..67 77 25±±00..00 22 9 9*

2.5 EdU 熒光標(biāo)記法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs DNA 合成的影響 激光共聚焦顯微鏡不同通道下觀察到處于細(xì)胞增殖期即DNA 合成期的EPCs 細(xì)胞核被染成綠色，而所有細(xì)胞核被染成紅色，同一細(xì)胞核如果雙染重合后則為黃色。經(jīng)過(guò)Aim Image Examiner 軟件分析結(jié)果顯示同樣經(jīng)過(guò)72 h 培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組處于DNA 合成期的比例［(89.00±5.30)%］高于對(duì)照組［(76.00±3.38)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖4 EdU 熒光標(biāo)記法檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs DNA 合成影響結(jié)果Figure 4 EPCs co-cultured with MSCs by EdU fluorescent assay

2.6 體外成血管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs 血管形成影響 實(shí)驗(yàn)組血管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)目和聯(lián)結(jié)點(diǎn)(13.53±2.33 和16.60±2.23)均較對(duì)照組(10.80±1.82和13.07±2.81)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 體外成血管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)MSCs 對(duì)EPCs 血管形成影響結(jié)果Figure 5 Tube-like structures and connection points of EPCs co-cultured with MSCs

3 討 論

1976 年，F(xiàn)riedenstein 等［13］首次從骨髓中分離出MSCs，1997 年，Asahara 等［14］首次從外周血中分離出EPCs，但隨后研究證實(shí)EPCs 源于骨髓［15］。相較于其他組織來(lái)源，骨髓中的MSCs 和EPCs 含量更為豐富且增殖能力更強(qiáng)［16］。本實(shí)驗(yàn)利用MSCs與EPCs 差時(shí)貼壁的特性［17］從一份骨髓中一次性將2 種細(xì)胞分離出來(lái)，此法簡(jiǎn)單易行，避免了分選和反復(fù)離心造成的細(xì)胞損傷和丟失，最大程度保存了MSCs 和EPCs 生長(zhǎng)所需的微環(huán)境，可使其保持旺盛的增殖能力。結(jié)果表明骨髓中的MSCs 貼壁時(shí)間較快，2 ～4 h 即可貼壁，而EPCs 貼壁較慢，實(shí)驗(yàn)在貼壁培養(yǎng)48 h 后收集未貼壁細(xì)胞另行用專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)，可粗略地將MSCs 與EPCs 分離。但差時(shí)貼壁的細(xì)胞成分仍較復(fù)雜，結(jié)合多次傳代以逐漸提高細(xì)胞純度。

MSCs 和EPCs 細(xì)胞形態(tài)無(wú)特異性，國(guó)內(nèi)外普遍采用檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞分化功能進(jìn)行鑒定。MSCs 較為公認(rèn)的是高表達(dá)Sca-1、CD29、CD73、CD90、CD105、CD44，同時(shí)低表達(dá)或不表達(dá)CD45、CD11b、CD34 等［18－19］，EPCs 普遍認(rèn)為高表達(dá)CD34、CD133、VEGFR2［20－21］。MSCs 功能鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)是向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的分化潛能［19，22－23］;EPCs的功能鑒定是能在基質(zhì)膠上形成血管腔樣結(jié)構(gòu)［22，24］。本實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的MSCs 和EPCs 經(jīng)流式檢測(cè)分別呈現(xiàn)Sca-1+CD29+CD45－CD11b－與CD34+CD133+VEGFR2+細(xì)胞群體特征，MSCs 經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞方向分化，EPCs 可在基質(zhì)膠上形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。

5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA 分子中，通過(guò)基于EdU 與Apollo?熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性。與BrdU 檢測(cè)方法相比，EdU 的熒光染料Apollo 的分子只有BrdU 抗體的1/500，在組織和細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，檢測(cè)方法更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確，且無(wú)需進(jìn)行化學(xué)處理，可有效避免樣品損傷，故近年取代Brd 用來(lái)檢測(cè)DNA 復(fù)制及細(xì)胞增殖［25］。標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞的過(guò)程與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，而染色率與細(xì)胞活性有關(guān)［26］，所以本實(shí)驗(yàn)根據(jù)EPCs 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行研究。用激光共聚焦顯微鏡拍照后，我們發(fā)現(xiàn)如果按照說(shuō)明書(shū)運(yùn)用Image-Pro plus 軟件來(lái)計(jì)算EPCs 的增殖率，肉眼計(jì)數(shù)會(huì)有一定的主觀性，所以采用了Aim Image Examiner 軟件計(jì)算，只要有DNA 合成的EPCs 細(xì)胞核部位就會(huì)被染上綠色，而全部細(xì)胞核則被染上紅色，然后計(jì)算所有被染上綠色部位的面積所占紅色部位的面積比例來(lái)檢測(cè)EPCs 的增殖能力。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組的EPCs 細(xì)胞核被染上綠色的部分更多，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的EPCs 的DNA 合成能力更強(qiáng)，這與傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的MTT 比色法結(jié)果一致，說(shuō)明當(dāng)EPCs 與MSCs 共培養(yǎng)時(shí)其增殖能力更強(qiáng)。

已有研究顯示，對(duì)心肌梗死和心肌病患者或動(dòng)物模型植入干細(xì)胞后能夠顯著改善心功能，減少惡性心律失常的發(fā)生并降低死亡率［27－28］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，植入的干細(xì)胞可以在心臟組織中分化為心肌樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的過(guò)程［29］。遺憾的是，近年來(lái)的研究表明只有少數(shù)移植的干細(xì)胞能夠到達(dá)梗死部位并分化為心肌樣細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞，所以難以用移植后干細(xì)胞分化為正常心肌細(xì)胞來(lái)解釋心功能改善的結(jié)果［30］。新的觀點(diǎn)認(rèn)為，干細(xì)胞除了定向分化為特定的細(xì)胞，旁分泌的多種細(xì)胞因子和富含microRNA 的囊泡才可能是改善梗死后心功能的主要因素［31－32］。而且，MSCs 旁分泌的生長(zhǎng)因子及其他生物活性物質(zhì)才是促進(jìn)血管形成的主要因素與細(xì)胞分化相關(guān)不大［33］。本實(shí)驗(yàn)中接種在上室的MSCs 旁分泌VEGF、IGF-1、FGF、PDGF、TGF-β、HGF等生長(zhǎng)因子及其它生物活性物質(zhì)可通過(guò)小室底部的濾膜進(jìn)入下室，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組EPCs 形成的小管樣結(jié)構(gòu)不論是數(shù)目還是聯(lián)結(jié)點(diǎn)都比對(duì)照組多，說(shuō)明MSCs 旁分泌的生物活性物質(zhì)對(duì)EPCs 的血管形成能力有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)只是在體外利用共培養(yǎng)體系證實(shí)MSCs對(duì)EPCs 的增殖和血管形成能力有促進(jìn)作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行心肌梗死動(dòng)物模型體內(nèi)聯(lián)合移植MSCs和EPCs，觀察治療作用并探討機(jī)制，以期為臨床細(xì)胞治療心肌梗死尋找到新的治療靶點(diǎn)或靶向藥物。

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