小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白在品種鑒定中的應(yīng)用研究

顏廷進(jìn)等

摘要：

以25個(gè)山東省小麥主推品種為試材，分別采用PAGE和SDS-PAGE技術(shù)對(duì)小麥醇溶蛋白及麥谷蛋白進(jìn)行分離，用以鑒定小麥品種。結(jié)果表明，醇溶蛋白PAGE技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組分的分離具有良好的多態(tài)性和特異性，該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成本低，是目前小麥品種鑒定的主要方法。麥谷蛋白SDS-PAGE技術(shù)具有譜帶清晰、分辨力較高等特點(diǎn)，但操作繁瑣，分離時(shí)間長(zhǎng)。對(duì)于醇溶蛋白難以區(qū)分的品種，麥谷蛋白可作為品種鑒定的有效補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞：醇溶蛋白；麥谷蛋白；PAGE；SDS-PAGE；品種鑒定

中圖分類號(hào)：S512.103.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2015）03-0105-04

Application Research of Gliadin and Glutenin

in Wheat Variety Identification

Yan Tingjin，Li Qun*，Dai Shuang，Tian Qian

（Shandong Center of Crop Germplasm Resources， Jinan 250100， China）

Abstract In order to determine the varieties of wheat， the gliadin and glutenin extracted from 25 wheat varieties were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）. The results showed that the gliadin PAGE technique， as the main method of wheat variety identification at present， had good polymorphism and specificity on separation of protein components with the advantages of simple operation， good repeatability and low cost. Glutenin SDS-PAGE technique showed clear hands and high resolution but time-consuming in operation. Glutenin could be an effective complement to varieties which was difficult to distinguish through gliadin.

Key wordsGliadin；Glutenin； PAGE；SDS-PAGE；Variety identification

隨著先進(jìn)分離技術(shù)的出現(xiàn)，近幾年小麥種子貯藏蛋白在分子水平上的研究得到較快發(fā)展。小麥籽粒蛋白按其溶解性可分為溶于水的白蛋白、溶于鹽的球蛋白、溶于酸或堿的谷蛋白和溶于醇的醇溶蛋白。白蛋白和球蛋白合稱為代謝蛋白，約占籽粒蛋白總量的15%左右。醇溶蛋白和谷蛋白合稱為貯藏蛋白，約占籽粒蛋白總量的85%左右。小麥醇溶蛋白是一種小分子單體蛋白；而麥谷蛋白是一種非均質(zhì)的大分子聚合體，靠分子內(nèi)和分子間的二硫鍵連結(jié)，呈纖維狀，容易發(fā)生聚集作用，根據(jù)其分子量的大小又分為高分子量谷蛋白（HMW）和低分子量谷蛋白（LMW）。

小麥貯藏蛋白組成成分僅由遺傳因素決定，不受發(fā)育時(shí)期的生理?xiàng)l件及外界環(huán)境因素的影響，因此能真實(shí)地反映出小麥品種之間基因表達(dá)上的差異。小麥醇溶蛋白在其組成上具有高度特異性和多態(tài)性，是區(qū)分小麥品種差別的重要蛋白質(zhì)成分之一，目前已廣泛應(yīng)用于種子純度鑒定、品種分類、品質(zhì)改良以及預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)等科研和生產(chǎn)中[1，2，4～10，13～16]；麥谷蛋白在品種間的變異廣泛，因此也可根據(jù)其組成上的差異對(duì)不同的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[3，7，11～13，17]。

目前小麥品種真實(shí)性和純度鑒定以醇溶蛋白PAGE電泳技術(shù)為主，但該技術(shù)對(duì)于有些品種特別是親緣關(guān)系比較近的品種難以區(qū)分，而關(guān)于小麥高分子量谷蛋白多用于其亞基的組成與小麥烘烤品質(zhì)關(guān)系和以及其遺傳變異小麥遺傳演化與群體分化的研究[2～11]。本研究試圖通過(guò)SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)麥谷蛋白組分進(jìn)行分析，作為醇溶蛋白電泳技術(shù)的補(bǔ)充，以便更好地區(qū)分小麥品種之間的差異。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用25個(gè)山東省小麥主推品種，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥研究室提供，見(jiàn)表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1小麥醇溶蛋白PAGE技術(shù)采用《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB/T3543.5-1995附錄A）聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）。

取單粒種子用粉碎器磨碎，置于離心管中，加樣品提取液200 μL，靜置2 h。提取液含0.05%甲基綠、25%α-氯乙醇。

取上清液12 μL進(jìn)行電泳。凝膠液（改進(jìn)后）含15%丙稀酰胺、0.5%N，N-亞甲基雙丙稀酰胺、6%尿素、0.005%硫酸亞鐵、0.1%抗壞血酸、0.1%甘氨酸、2%醋酸。電極緩沖液含0.04%甘氨酸、0.4%醋酸。

采用垂直板夾芯電泳槽，恒壓350 V，電泳1 h關(guān)機(jī)。0.5%考馬斯亮藍(lán)和10%三氯乙酸以1∶20比例混合，將凝膠片放入，染色1 h即可觀察圖譜。

1.2.2麥谷蛋白SDS-PAGE技術(shù)參照《小麥植物新品種測(cè)試指南》中規(guī)定的SDS-PAGE測(cè)定高分子量麥谷蛋白方法。endprint

每品種取10粒種子，單粒粉碎放入2 mL離心管中，加入500 μL提取液[含0.09 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.03% SDS、0.015%溴酚藍(lán)、15%甘油、7.5%巰基乙醇]，振蕩混勻，室溫下提取2 h，沸水浴10 min，離心5 min，取上清液。

SDS-PAGE凝膠電泳采用不連續(xù)分離系統(tǒng)。分離膠含10% Acry、0.13% Bis、0.38 mol/L Tris-HCl （pH 8.8），0.1% SDS；濃縮膠含4% Acry、0.06% Bis、0.17 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.1% SDS；電極緩沖液（pH 8.8）含1.4% Gly、0.3% Tris、0.1% SDS。

采用垂直板夾芯電泳槽，恒壓100 V，電泳12 h。染色液含10%三氯乙酸、0.025%考馬斯亮藍(lán)R-250，染色4 h。用蒸餾水浸泡8 h，直至膠片背景變淺或無(wú)色。

2結(jié)果與分析

2.1醇溶蛋白PAGE分離結(jié)果

在聚丙烯酰胺（PAGE）電泳條件下，小麥醇溶蛋白能分成15～30個(gè)組分，按其分子量大小分為α、β、γ、ω 4種蛋白，品種區(qū)分主要以α蛋白為主。結(jié)果顯示，該技術(shù)對(duì)于醇溶蛋白的分離表現(xiàn)出良好的多態(tài)性（圖1），25個(gè)小麥品種中有17個(gè)品種有明顯的特征帶，具有很好的特異性。但仍有4組品種電泳圖譜相似，具體表現(xiàn)為第4號(hào)帶（煙農(nóng)2415）和第5號(hào)帶（煙農(nóng)5158）相似、第12號(hào)帶（良星66）和第13號(hào)帶（良星99）相似、第21條帶（濰麥8號(hào)）和第23條帶（萊州137）相似、第1號(hào)帶（汶農(nóng)14）和第25號(hào)帶（良星619）相似。究其原因，煙農(nóng)2415和煙農(nóng)5158、良星66和良星99分別為同一育種單位選育出來(lái)的品種，親緣關(guān)系比較近，遺傳背景狹窄；濰麥8號(hào)和萊州137、汶農(nóng)14和良星619兩組品種可能具有共同的親本或相近的親緣關(guān)系，因此利用該技術(shù)無(wú)法區(qū)分其品種間的差異。

2.2麥谷蛋白SDS-PAGE分離結(jié)果

利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)可將麥谷蛋白分為高分子谷蛋白和低分子谷蛋白，從電泳圖譜可以看出（圖2），該項(xiàng)技術(shù)也具有很好的多態(tài)性，其中高分子量谷蛋白具有較好的特異性，25個(gè)小麥品種中的19個(gè)都具有明顯的特征帶，很容易和其他品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。但也有3組品種電泳圖譜相似，其中12和13號(hào)譜帶（良星66和良星99）、1和25號(hào)譜帶（汶農(nóng)14和良星619）完全相似；17和18號(hào)譜帶（青麥6號(hào)和濟(jì)寧16）在高分子蛋白區(qū)相似，但在低分子蛋白區(qū)有差異；在醇溶蛋白電泳圖譜中表現(xiàn)相似的4號(hào)帶和5號(hào)帶（煙農(nóng)2415和煙農(nóng)5158）、21號(hào)帶和23號(hào)帶（濰麥8號(hào)和萊州137）在麥谷蛋白電泳圖譜中卻具有特異性，二者很容易區(qū)分。

蛋白質(zhì)作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，其圖譜的差異反映基因的差異。就整個(gè)電泳圖譜來(lái)看，高分子量亞基相同的品種，低分子量亞基也可能存在差異，因此品種的鑒別除從麥谷蛋白高分子量亞基來(lái)判斷性狀差異外，還可以考慮低分子量亞基。

3討論與結(jié)論

3.1醇溶蛋白電泳方法具有簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠、低成本等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于小麥品種鑒定，同時(shí)也被《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》采用，可作為檢驗(yàn)方法的首選，滿足種子檢驗(yàn)數(shù)量大、品種多的需求。麥谷蛋白SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜清晰，分辨率較高，但分離時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，可作為補(bǔ)充。對(duì)于少數(shù)因遺傳基礎(chǔ)相近，在田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)有差異，而在蛋白質(zhì)水平無(wú)法鑒定的品種，則可采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)。

3.2種子貯藏蛋白的組成由遺傳物質(zhì)決定，不受環(huán)境影響，其組成的差異可以反映基因型的不同。小麥?zhǔn)亲曰ㄊ诜圩魑?，品種的基因型為純合型，一個(gè)品種通常只有一種蛋白質(zhì)的電泳圖譜[18]。醇溶蛋白和麥谷蛋白作為品種鑒定的生化指標(biāo)，只要測(cè)試品種與標(biāo)準(zhǔn)品種電泳圖譜不同，就可以作為有差異的性狀。

在小麥品種純度和真實(shí)性鑒定實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)以醇溶蛋白電泳技術(shù)為主要的檢測(cè)體系，輔以麥谷蛋白電泳技術(shù)，二者相互補(bǔ)充，對(duì)于農(nóng)作物品種鑒定、遺傳分類、品質(zhì)分析都具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]

顏啟傳，黃亞軍，徐媛.我國(guó)適用的小麥和大麥種子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定品種的標(biāo)準(zhǔn)程序[J].種子，1989（6）：55-57.

[2]閻旭東，盧少源，李宗智.適用于我國(guó)小麥醇溶蛋白分析的APAGE方法[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，17（1）：7-10.

[3]晏月明，劉廣田，Prodanovic S.小麥谷蛋白亞基的凝膠電泳分離及其品種鑒定[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，1998，13（6）：1-5.

[4]邵錦，丁毅.麥醇溶蛋白A-PAGE方法的優(yōu)化和改進(jìn)[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，46（6）：733-738.

[5]高居榮，王洪剛，劉樹(shù)兵，等.小麥種子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的簡(jiǎn)化研究 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2003，18（2）：43-46.

[6]董洪平.小麥醇溶蛋白電泳分析及其在品種分類上的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)， 1999，13（2）：1-4.

[7]董超華，徐如洪，張慶勤.小麥醇溶蛋白和谷蛋白研究進(jìn)展[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2003，22（2）：164-168.

[8]張茶，梁虹，王睿輝，等.河北省主栽小麥品種醇溶蛋白遺傳多樣性分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（1）：191-193.

[9]張學(xué)勇，楊欣明，馬守才，等.醇溶蛋白電泳在小麥種質(zhì)資源遺傳分析中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，28（4）：25-32.

[10]馬守才，張改生，劉宏偉，等.多種小麥蛋白質(zhì)酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法研究[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2000，20（4）：55-58.endprint

[11]司學(xué)芝，李建偉 王金水，等.麥醇溶蛋白和麥谷蛋白提取條件的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（3）：33-39.

[12]虎夢(mèng)霞.小麥低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GS）研究進(jìn)展[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2014（1）：43-46.

[13]牛瑜琦，劉少翔，閆貴云，等.小麥高分子量谷蛋白亞基研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（3）：11-15.

[14]Dachkevitch T，Redaelli R，Biancardi A M，et al.Genetics of gliadins coded by the group 1 chromosomes in the high-quality bread wheat cultivar Neepawa[J].Theor.Appl.Genet.，1993，86（3）：389-399.

[15]Cox T S，Lookhart G L，Walker D E，et al.Genetic relationships among hardred winter wheat cultivars as evaluated by pedigree analysis and gliadin polyacrylamide gel electrophoretic patterns[J].Crop Sci.，1985，25：1058-1063.

[16]Payne P I.Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation in bread-making quality[J].Annual Review of Plant Biology，2003，38：141-153.

[17]Jackson E A，Holt L M，Payne P I.Characterizations of high molecular weight gliadin and low molecular weight glutenin subunits of wheat endosperm by two-dimension electrophoresis and the chromosomal localization of their controlling genes[J].Thero.Appl.Genet.，1983，66（1）：29-37.

[18]蘭海燕，李立會(huì).蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（8）：916-920.endprint