當歸補血湯對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌纖維化的影響*

曾 宇，張三印

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137)

當歸補血湯對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌纖維化的影響*

曾 宇，張三印△

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137)

目的 探討當歸補血湯對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌纖維化的影響。方法 50只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、當歸補血湯大劑量組、當歸補血湯小劑量組、陽性對照組。除空白對照組，其它四組大鼠給予背部皮下注射異丙腎上腺素5 mgkg-1d-1，連續(xù)10天。陽性對照組給予卡托普利50 mg/kg-1灌胃，當歸補血湯大和小劑量組給予當歸補血湯各7.56 g/kg-1和3.78 g/kg-1灌胃，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每天一次。連續(xù)給藥28d后，給予血流動力學檢測，計算心臟指數(shù)，病理檢測，Hpy含量檢測。結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組的心臟指數(shù)升高(P<0.05)，左心功能降低，Hpy含量增加(P<0.01)。與模型對照組比較，當歸補血湯大劑量、小劑量組大鼠心肌纖維化病變程度降低，心臟組織的Hpy含量降低，左心功能有改善。結(jié)論 當歸補血湯能抑制心肌間質(zhì)細胞產(chǎn)生膠原蛋白，減輕心肌纖維化，改善左心功能。

心肌纖維化；當歸補血湯；羥脯氨酸

心肌纖維化(Myocardial Fibrosis)是由多種心血管疾病發(fā)展到一定程度時可引起心肌纖維，并逐漸發(fā)展為慢性缺血性心臟病；同時在心肌纖維化是心室重構(gòu)的關(guān)鍵原因，出現(xiàn)舒張功能障礙[1-2]。因此加強對心肌纖維化的研究和防治具有重要的臨床意義。我國的中醫(yī)藥對心肌纖維化有獨特的療效[3-4]，且副作用少。當歸補血湯是金典的補氣益氣方，由當歸和黃芪兩味中藥組成，其治療心血管疾病的報道屢見不鮮，療效顯著。本研究觀察當歸補血湯對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌纖維化的影響。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠 50只，雄性，體重200-220 g，SPF級，購自簡陽市簡城比爾動物養(yǎng)殖場，許可證號SCXK(川)2013-24。

1.2 藥品與試劑 異丙腎上腺素(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)，卡托普利(汕頭金石制藥廠)。當歸(產(chǎn)于甘肅)、黃芪(產(chǎn)于內(nèi)蒙古)由成都中醫(yī)藥大學生藥教研室國錦琳副教授鑒定。當歸180 g，黃芪900 g，水煎，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為每毫升含1 g藥。Elisa試劑盒(Abcam公司)。水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)。無水乙醇(成都科龍化工試劑廠)。二甲苯(成都科龍化工試劑廠)。甲苯胺藍(上海如吉生物科技發(fā)展公司)。蘇木素(北京百靈威科技有限公司)。麗春紅(成都科龍化工試劑廠)。

1.3 儀器 Powerlab生理記錄系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，電子秤(德國Sartorius公司)，酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)，電子恒溫浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，移液槍(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)，槍頭(美國Axygen公司生產(chǎn))，EP管(美國Axygen公司生產(chǎn))

2 方法

2.1 心肌纖維化動物模型的制備 大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素5 mg/kg-1·d-1，連續(xù)10d。自由進食進水，空白對照組注射同體積的生理鹽水。

2.2 分組與給藥 大鼠隨機分為5組，空白對照組，模型對照組，陽性對照組，DBT大劑量組、DBT小劑量組。每組10只。灌胃給藥28 d，每天1次，陽性對照組給予卡托普利50 mg/kg-1，DBT大和DBT小劑量組分別給予當歸補血湯7.56 g/kg-1和3.78 g/kg-1灌胃，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水。

2.3 心功能檢測 灌胃28天后，稱重，用10%水合氯醛0.3 mL/kg-1腹腔注射麻醉大鼠。固定。剪去頸部毛，頸部做一“L”型切口，分離筋膜和肌肉，找到頸動脈鞘，分離出頸總動脈。結(jié)扎頸總動脈遠心端，動脈夾夾住近心端，在結(jié)扎處附近做以小切口，插入Millar導管，固定導管，松開動脈夾，繼續(xù)推入導管，觀察電腦屏幕血壓的變化，當有落空感和血壓最低接近0 mmHg，出現(xiàn)心室波時，則導管進入左心室[5]。選擇一段好的波形進行軟件分析。

2.4 標本采集與制備 心功能檢測完后，剪開胸腔，取出心臟，蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，分離左心室，分別稱出全心重量和左心室重量。在近心尖5 mm處取左心室組織，固定，制備病理切片。剩余左心室組織保存于-80℃冰箱中，用于測量心肌Hyp含量。

2.5 組織病理學與心肌纖維化檢測 大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(5 um)，分別進行HE染色和MASSON膠原特異染色。對切片進行圖像采集，每張切片于100倍下觀察組織，再根據(jù)表達情況分別選取1-3個區(qū)域400倍采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定采集全部圖像的平均光密度，取平均值。

2.6 心肌組織Hyp含量測定 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)測定大鼠心肌組織羥脯氨酸(Hyp)的水平。向預先包被了大鼠羥脯氨酸單克隆抗體的酶標孔中加入羥脯氨酸，溫育；溫育后加入生物標記的抗Hyp抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復合物，去除為結(jié)合的酶，加入顯色劑。顏色的深淺與樣品中大鼠羥脯氨酸的濃度呈正相關(guān)。

3 結(jié)果

3.1 對心肌纖維化大鼠心臟指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型對照組的心臟指數(shù)升高(P<0.05)，表明異丙腎上腺素能促進心肌膠原纖維增生，是心臟質(zhì)量增加。與模型對照組比較，DBT大劑量組、DBT小劑量組和陽性對照組的心臟指數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。空白對照組、DBT大劑量組、DBT小劑量組、陽性對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 當歸補血湯對心肌纖維化大鼠心臟指數(shù)的影響±s，n=8)

注：與模型對照組比較，#P<0.05。

3.2 對心肌纖維化大鼠心功能的影響 與空白對照組比較，模型對照組SW、CO、Pes、EF、dP/dt max、-dP/dt min、-dV/dt min降低(P<0.05)，表明異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化大鼠左心功能下降。與模型對照組比較：DBT大劑量組SW、EF、dV/dt max、-dV/dt min升高(P<0.05)；DBT小劑量組EF、-dV/dt min升高(P<0.05)；陽性對照組EF升高(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)表明DBT大劑量和DBT小劑量有改善大鼠左心功能的作用。見表2。

表2 當歸補血湯對心肌纖維化大鼠心功能的影響±s，n=8)

注：#P<0.05，與空白對照組比較；*P<0.05，與模型對照組比較。1mmHg≈0.133kPa。SW：每搏功，CO：每分心輸出量，Ped：舒張壓，Pes：收縮壓，EF：射血分數(shù)，dP/dt max：壓力上升速率最大值，-dP/dt min：壓力下降速率最大值，dV/dt max：容積上升速率最大值，-dV/dt min：容積下降速率最大值。

3.3 當歸補血湯對心肌組織病理變化的影響 空白對照組心肌纖維排列正常。模型對照組的心肌纖維排列紊亂，可見波浪樣變，心肌間隙增大，部分心肌細胞變性和溶解壞死，肌間纖維結(jié)締組織大片增生，毛細血管擴張增生，其間可見大量單核、淋巴細胞的浸潤和成纖維細胞的增生。與模型對照組比較，DBT大劑量和DBT小劑量及陽性對照組的心肌纖維化病灶局限，病變明顯較輕，表明當歸補血湯可以減輕異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化。見圖1、2。

圖1 當歸補血湯對心肌組織病理變化的影響(HE染色，×400)

圖2 當歸補血湯對心肌組織病理變化的影響(MASSON染色，×400)

3.4 對心肌纖維化大鼠心臟組織Hpy的影響 模型對照組大鼠心肌組織中Hpy含量顯著高于空白對照組(P<0.01)；DBT大劑量組與陽性對照組心肌組織中Hpy含量明顯低于模型對照組；DBT小劑量組大鼠心肌組織中Hpy含量降低不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 當歸補血湯對各組大鼠心臟組織Hpy的影響±s，n=8)

注：#P<0.05、##P<0.01，與空白對照組比較；*P<0.05、**P<0.01，與模型對照組比較。

4 討論

當歸補血湯是金元時代李東恒所創(chuàng)的益氣補血方劑，由黃芪和當歸兩味藥以5∶1比例組成，具有促進造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護心腦血管等作用[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪、當歸有抑制膠原增生，減輕心肌纖維化的作用[8-10]。因此本實驗采用金典方當歸補血湯對心肌纖維化大鼠進行研究，推廣當歸補血湯的應用。

研究表明[11]，卡托普利可以抑制大鼠心肌纖維化，故本實驗以卡托普利作為陽性對照藥物。

異丙腎上腺素屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，連續(xù)皮下注射造成多發(fā)性灶狀心肌壞死導致心肌纖維化[12-13]。本實驗中模型對照組大鼠心臟指數(shù)、心肌Hpy含量明顯高于空白對照組，病理切片可見大量膠原纖維增生，左心功能明顯下降；表明大鼠心肌纖維化模型建立成功。DBT大劑量組大鼠心臟組織的Hpy含量明顯低于模型對照組；DBT小劑量也有降低，但無統(tǒng)計意義。從生化檢驗和形態(tài)學分析表明，大劑當歸補血湯能抑制心肌間質(zhì)細胞產(chǎn)生膠原蛋白，減輕心肌纖維化，改善了左心功能。有研究表明異丙腎上腺素引起心肌纖維化不僅與自身的β受體激動劑的特點有關(guān)，還與影響心肌纖維化形成的細胞因子有關(guān)[14-15]，因此當歸補血湯改善異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化的分子機制，還需進一步研究。

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Influence ofDangguiBuxueDecoctionon Myocardial Fibrosis of Isoproterenol Induced Rats

ZENG Yu, ZHANG San-yin

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137,Sichuan)

Objective: To study the influence ofDangguiBuxueDecoction(DBD) on myocardial fibrosis of isoproterenol-induced rats. Methods: 50 SD rats were randomly divided into a normal control group, a model group, a DBD high-dose group, a DBD low-dose group and a positive control group. Except the normal control group, the rats of other four groups were given subcutaneous injection of isoproterenol 5 mg/kg-1d-1for 10 days. The positive control group was given intragastric infusion of captopril 50 mg/kg-1. The DBD high-dose and low-dose groups were given intragastric infusion of DBD 7.56 g/kg-1and 3.78 g/kg-1respectively. The normal control group and the model group were given intragastric infusion of equivoluminal?normal saline, once a day. After 28-day successive administration, hemodynamics detection, cardiac index calculation, pathological examination and Hpy content detection were made. Results: When compared with the normal control group, the cardiac index of the model group increased (P<0.05), their left ventricular function decreased and Hpy content increased (P<0.01). When compared with the model group, the DBD high-dose and low-dose groups reduced the severity of myocardial fibrosis lesion of the rats and their Hpy content of heart tissue decreased and their left ventricular function improved. Conclusion: DBD can inhibit myocardial interstitial cells to produce collagen, reduce myocardial fibrosis and improve left ventricular function.

myocardial fibrosis,DangguiBuxueDecoction, hydroxyproline

國家自然科學基金項目(81001497)，成都中醫(yī)藥大學?；痦椖?030018060)。

曾宇(1986-)，女，漢族，四川，助教，碩士，研究方向：中醫(yī)藥及血管生成，E-mail：595279347@qq.com。

△通信作者：張三印(1976-)，男，漢族，陜西，教授，博士，研究方向：中醫(yī)藥及血管生成，E-mail：tcmzsy@126.com。

R541

A

1007-2349(2015)07-0017-05

2015-05-17)