安吉白茶白化葉和返綠葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素及其前體物含量的比較

楊熒 呂立堂 趙德剛

摘要：安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）是典型的白化茶樹(shù)品種，為了對(duì)其葉片白化現(xiàn)象進(jìn)行探究，本研究觀察了安吉白茶的白化葉和返綠葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)白化葉葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，基粒片層排列疏松散亂，片層間縫隙大，層次不清晰，甚至斷裂不成形，根據(jù)對(duì)葉綠素及其前體物質(zhì)含量的測(cè)定和對(duì)葉綠素合成的相關(guān)基因在兩個(gè)階段葉片中的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mg-proto Ⅸ在白化葉中含量要高于返綠葉，推測(cè)葉綠素合成階段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻，確定安吉白茶發(fā)生白化是由于葉綠體發(fā)育不良，同時(shí)葉綠素合成階段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a時(shí)受阻所致。

關(guān)鍵詞：安吉白茶;葉綠體;超微結(jié)構(gòu);葉綠素前體物

中圖分類號(hào)：S5711

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）06-0071-05國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.013

Comparison of Ultrastructure， Chlorophyll and Precursor Contents of Chloroplasts between Albino Leaves and Green Leaves in Camellia sinensis ‘Baiyel 1

YANG Ying1，LV Li-tang2*，ZHAO De-gang1，3

（1.College of Tea / Research Institute of Agricultural Bioengineering， Guizhou University， key Laboratory of Germplasm Innovation for Conservation and Protection of Mountain Plant Resources， Guiyang， Guizhou 550025，China;2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Camellia sinensis cv. Baiye1 is a typical albino tea cultivar. In order to investigate the albinism phenomenon of its leaves， the chloroplast ultrastructure of the albino leaves and the green leaves of Camellia sinensis cv. Baiye1 were observed， and it was found that the internal structure of the chloroplasts in the albino leaves was stunted. The grana lamellae were scattered and loosely arranged with big gaps， and the lamellar structure was not clear， even fractured. According to the determination of the content of chlorophyll and its precursors， and the expression of genes related to chlorophyll synthesis in leaves of two stages ， it was found that the content of Mg-proto IX in albino leaves was significantly higher than that in returning green leaves and speculated that the synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX was blocked in the chlorophyll synthesis pathway. These results indicate that the albinism of Camellia sinensis cv. Baiye1 was due to chloroplast dysplasiaand the blocking synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX.

Key words：Camellia sinensis cv. Baiyel; chloroplast; ultrastructure; chlorophyll precursor

茶湯中含有的茶多酚、氨基丁酸、脂多糖，微量元素錳、鋅、硒，茶坩寧等具保健作用，以茶樹(shù)白化突變體為原料制成的綠茶滋味鮮爽，香氣、外形、湯色、葉底等品質(zhì)優(yōu)秀，提高了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，同時(shí)由于葉綠素含量降低，氨基酸含量明顯增高，使茶樹(shù)白化突變體制成的茶具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]，植物的葉色突變與葉綠素的合成及葉綠體的發(fā)育息息相關(guān)[3-4]，安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）作為典型的白化茶品種，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)返白過(guò)程中氨基酸升高，葉綠素含量則下降[5]。本研究以安吉白茶為研究材料，對(duì)其白化葉和返綠葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素及其前體物含量進(jìn)行比較和研究，以揭示安吉白茶白化的原因。

1材料與方法

11材料

安吉白茶（Camellia sinensis ‘Baiye1）的白化葉及返綠葉作為研究材料，采樣于中國(guó)貴州六盤水市六枝特區(qū)黑曬村茶園（由四川引種），白化葉和返綠葉均處于相同的葉片發(fā)育階段，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

供試品種：云煙87。供試煙桿醋液：由貴州省煙草科學(xué)研究院制備。自然風(fēng)干的煙桿進(jìn)行干餾處理后，除得到炭之外。還能收集到一些液態(tài)干餾物，其中間一層赤黃色的液體通過(guò)靜置過(guò)濾后所得液體，pH為376。

12試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年3月至6月在貴州省煙草科學(xué)研究院福泉基地進(jìn)行。普通塑料大棚內(nèi)，采用漂浮育苗法培育煙苗。苗床高10 cm，水深4 cm。以不添加煙桿醋液為對(duì)照（CK），設(shè)置3個(gè)煙桿醋液濃度處理：T1，煙桿醋液稀釋200倍;T2，煙桿醋液稀釋400倍;T3，煙桿醋液稀釋600倍。分別于播種前、播種后20 d和播種后40 d分3次添加煙桿醋液，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)。苗期管理按烤煙集約化育苗技術(shù)規(guī)程操作。

13測(cè)定項(xiàng)目及方法

育苗盤每穴播1粒種子，播種后15、20、30 d調(diào)查出苗率[出苗率（%）=出苗種子數(shù)/試驗(yàn)用種子數(shù)。在成苗期（8葉1心）每盤隨機(jī)取5株煙苗，參照《YC/T142—1998煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》，測(cè)定煙苗的莖高、莖圍、地上部分與地下部分干重等;

采用WinRHIZO植物根系掃描系統(tǒng)測(cè)定幼苗根系結(jié)構(gòu);采用乙醇提取法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量[13];采用TTC法測(cè)定煙苗根系活力[14];采用 Li￣6400XT 便攜式光合作用測(cè)定儀和 6400￣02B紅藍(lán)光源（美國(guó)Li￣cor公司）測(cè)定幼苗光合指標(biāo);采用M系列IMAGING￣PAM （WALZ，德國(guó)）調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，選擇煙苗第2～3片葉自上而下進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定;采用磺胺-萘胺比色法測(cè)定煙苗硝酸還原酶活性[15]。

2結(jié)果與分析

21煙桿醋液對(duì)烤煙種子出苗的影響

由表1可以看出，煙桿醋液不同稀釋濃度對(duì)烤煙種子出苗影響不同，出苗率均隨育苗期延長(zhǎng)而增大，未出現(xiàn)完全不出苗現(xiàn)象。CK處理在播種后15、20、30 d的出苗率與T2處理無(wú)明顯差異，且均高于T1處理;而T3處理在播后15、20 d的出苗率低于CK及T2處理，在播后30 d則高于CK及T2處理。播種后30 d，T3處理較CK、T2處理的出苗率分別高284、305個(gè)百分點(diǎn)。這說(shuō)明煙桿醋液對(duì)烤煙種子出苗有影響，且隨培育時(shí)間的延長(zhǎng)，T3處理的種子出苗率高于其他處理的種子出苗率。

22煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗植物學(xué)性狀的影響

由表2可知，煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗的生長(zhǎng)有較大影響，在烤煙幼苗成熟期，不同煙桿醋液的稀釋濃度處理均改變了烤煙幼苗植物學(xué)性狀。從整體指標(biāo)可以看出，T1處理下的植物學(xué)性狀顯著弱于T3處理，且T3處理莖高較T1處理的增幅為683%，差異達(dá)到顯著水平，說(shuō)明高濃度下煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗的生長(zhǎng)效果弱于低濃度處理。各處理莖葉重范圍為08102～09500 g/株，且莖葉重隨煙桿醋液濃度減小而增大;T2處理與對(duì)照處理間無(wú)顯著性差異，但植物學(xué)性狀均強(qiáng)于T1處理?？緹熡酌缰参飳W(xué)性狀綜合表現(xiàn)為較低濃度處理效果優(yōu)于高濃度處理。

23煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗根系結(jié)構(gòu)的影響

根系結(jié)構(gòu)可反應(yīng)植株生長(zhǎng)情況。從表3可以看出，煙桿醋液稀釋400倍處理較對(duì)照處理有一定影響，但不明顯，無(wú)顯著差異，尤其以總根表面積與根尖數(shù)未達(dá)到顯著水平。而煙桿醋液稀釋600倍處理較其他處理對(duì)烤煙幼苗根系結(jié)構(gòu)的影響有一定差異，根系生長(zhǎng)明顯優(yōu)于其他稀釋倍數(shù)處理，即低濃度下煙桿醋液的表現(xiàn)最佳。各處理下根尖數(shù)范圍為3276～3544，其中T3處理較對(duì)照及T1處理的增幅分別為225%、818%，同樣說(shuō)明高濃度下的煙桿醋液的根尖數(shù)顯著低于低濃度處理。

24煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗根系活力的影響

從圖1可以看出，煙桿醋液的施用對(duì)烤煙幼苗根系活力的影響較大，煙苗成苗期CK、T1、T2、T3處理根系活力為別為0503、0392、0534、 0621 mg·g-1·h-1。在煙桿醋液稀釋200～600倍的范圍內(nèi)，隨煙桿醋液稀釋倍數(shù)的增大，各處理下烤煙幼苗根系活力均顯著提高，其中T3處理顯著高于 CK、T1、T2處理，且差異顯著，增幅分別為2346%、5842%、1629%。由此說(shuō)明，煙桿醋液稀釋較高倍數(shù)下的處理表現(xiàn)最好，對(duì)于根系活力的提高有明顯作用。

25煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗色素含量的影響

植物在進(jìn)行光合作用時(shí)主要通過(guò)光合色素捕獲光能，而葉綠素和類胡蘿卜素起主要作用。從表4可以看出，煙桿醋液的施用對(duì)烤煙幼苗的色素含量產(chǎn)生了影響?？緹熡酌缭谂嘤脸擅缙跁r(shí)，CK處理及T2處理下總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量的變化趨勢(shì)相近，其含量處于T1及T3處理間。以T1處理的色素含量最低，T3處理色素含量最高，二者間存在顯著性差異，其中類胡蘿卜素含量差異達(dá)到顯著水平，T3是T1處理含量的015倍?？傮w而言，不同處理下烤煙幼苗色素含量表現(xiàn)為高濃度煙桿醋液下的色素含量低于低濃度處理。

26煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗氣體交換參數(shù)的影響

從表5可以看出，除T1處理外，烤煙幼苗成苗期的各濃度處理均對(duì)烤煙幼苗光合特性有一定程度的促進(jìn)作用，且各氣體交換參數(shù)隨著煙桿醋液濃度降低而增大。其中，各處理下幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及胞間二氧化碳濃度均以T3處理最大，其次是T2 處理及CK處理。T1處理較CK、 T2、T3處理均有差異，但較T3處理差異顯著;不同處理下蒸騰速率及胞間二氧化碳濃度表現(xiàn)趨勢(shì)較接近。由此說(shuō)明較低濃度下的煙桿醋液更能促進(jìn)烤煙幼苗的光合特性。

27煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

植物葉綠素?zé)晒庑盘?hào)是一種理想的光系統(tǒng)探針，能反應(yīng)植物的生理生態(tài)及其與環(huán)境的關(guān)系[16]。Fv/Fm值是暗反應(yīng)條件下PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，即潛在的光合速率;Y（Ⅱ）值是 PSII反應(yīng)中心在有部分關(guān)閉情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率，即實(shí)際的光合速率[17];qP是光化學(xué)猝滅。由表6可以看出，整體上，各處理的最大光化學(xué)效率 （Fv/Fm）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、實(shí)際光合速率Y（Ⅱ）均高于煙桿醋液稀釋200倍（T1）處理;NPQ 是非光化學(xué)猝滅，表示不能被電子傳遞利用的以非光化學(xué)形式釋放的過(guò)剩光能，能夠保護(hù)光合系統(tǒng)[18]。表中不同處理的NPQ均不同程度低于T1處理，其中以煙桿醋液稀釋600倍（T3）處理表現(xiàn)出最小值。結(jié)果看出，除NPQ外，烤煙幼苗的Fv/Fm、qP、Y（Ⅱ）的值均隨煙桿醋液稀釋倍數(shù)的增加呈增大趨勢(shì)。

28煙桿醋液對(duì)烤煙幼苗NR活性的影響

硝酸還原酶是NO3-同化過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，其活性能夠表明植株?duì)I養(yǎng)狀況和氮代謝水平[19]。由圖2可知，不同處理間煙苗成苗期硝酸還原酶活性差異顯著。其中，T3及CK處理NR分別為6645、6202 μg/g·h，T3處理較對(duì)照處理增加了714%，同時(shí)其NR活性顯著高于T1處理;T2與CK處理間無(wú)顯著差異，但都高于T1處理。由此說(shuō)明，高濃度下的煙桿醋液影響了烤煙幼苗的營(yíng)養(yǎng)情況，抑制了烤煙幼苗的氮代謝。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在常規(guī)漂浮育苗的基礎(chǔ)上施用煙桿醋液，不同的稀釋倍數(shù)處理下烤煙幼苗生育表現(xiàn)出不同的差異。在煙苗培育后期，煙桿醋液稀釋200倍處理下的烤煙種子出苗率均低于其他處理，這與劉艷梅等[20]研究的高濃度竹醋發(fā)酵液抑制種子發(fā)芽的試驗(yàn)結(jié)果類似。許靈杰等[21]的研究結(jié)果表明，相對(duì)較低濃度下的木醋液對(duì)種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。同樣，本試驗(yàn)前期以煙桿醋液較低濃度（稀釋400倍）處理較其他濃度更能促進(jìn)烤煙種子出苗，有較高的出苗率，而在成苗期稍低于600稀釋倍數(shù)。這或許是高濃度的煙桿醋液在短期內(nèi)促進(jìn)了部分有益微生物的活性，不但分解了烤煙種子在萌發(fā)過(guò)程中的有害物質(zhì)，還分泌了種子萌發(fā)所需的激素及酶類，因而，前期高濃度處理下的煙桿醋液促進(jìn)了烤煙種子的出苗。但隨著培育時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物的生長(zhǎng)會(huì)增加對(duì)部分元素的需求，從而減少了種子萌發(fā)所需元素，因此，在培育后期，低濃度煙桿醋液處理下的出苗率反而高于高濃度處理[22-23]。

在成苗期，除煙桿醋液稀釋200倍處理外，隨著煙桿醋液稀釋倍數(shù)的增大，植物學(xué)性狀及根系結(jié)構(gòu)依次得到改善，原因可能是煙桿醋液中所具有的類似激素類物質(zhì)能調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)[24]，而生物質(zhì)材料中確實(shí)富含能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[25]。但高濃度處理卻抑制了烤煙幼苗的生育，說(shuō)明煙桿醋液濃度存在一定的閾值。豐明曉等[26]的研究結(jié)果也表明了木醋液調(diào)節(jié)途徑與生長(zhǎng)素IAA相似。本試驗(yàn)中，T3處理下烤煙幼苗成苗期根系活力較CK處理得到提升，與王曉等[27]研究的木醋液在稀釋倍數(shù)相對(duì)較高的處理下能促進(jìn)烤煙根系活力的結(jié)果相似。原因可能是一定濃度的煙桿醋液能提高根際有益微生物的數(shù)量，分泌能夠促進(jìn)根系活力、養(yǎng)分吸收的代謝產(chǎn)物[28]。色素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其光合速率來(lái)自于色素的組成與比例[29]。毛凱倫等[12]通過(guò)葉面噴施木醋液于烤煙，結(jié)果增加了烤煙煙葉的色素含量，促進(jìn)了烤煙的生育。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。原因可能是煙桿中含有植物堿鹽、單寧、色素、有機(jī)酸鹽、氨基酸、蛋白質(zhì)等[30]，煙桿醋液通過(guò)對(duì)作物光合作用及生理代謝等方面的調(diào)控，促進(jìn)了氮利用率，從而達(dá)到了提高烤煙幼苗色素含量的目的。光合生理指標(biāo)可作為植物對(duì)光能利用能力最綜合的評(píng)價(jià)[31]。試驗(yàn)中，施用煙桿醋液稀釋200倍處理下的各生理指標(biāo)低于CK對(duì)照，或許是高濃度煙桿醋液的施用對(duì)吸收光強(qiáng)產(chǎn)生了影響。光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，是植物合成有機(jī)物質(zhì)和獲得能量的根本[32]。通過(guò)熒光參數(shù)分析可了解光合機(jī)構(gòu)內(nèi)部調(diào)節(jié)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，T3處理下，F(xiàn)v/Fm、qP及Y[II]值較CK處理大，NPQ較CK處理小，說(shuō)明葉片吸收的光能較充分，PSII電子傳遞能力較強(qiáng)，光合碳同化所需的ATP 較為充足。可見(jiàn)，煙桿醋液低濃度處理更能促使光耗散減少，對(duì)強(qiáng)光具有最大適應(yīng)性。推測(cè)原因可能是煙桿醋液改善了烤煙幼苗根際微生物環(huán)境，提高了幼苗PSII反應(yīng)中心的潛在活性和實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率。植物的氮素代謝取決于硝酸還原酶活性[33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，煙桿醋液稀釋倍數(shù)在越大的情況下更能促進(jìn)煙苗葉片中NR的形成，使煙苗氮代謝改善，進(jìn)而對(duì)氮的吸收利用提高。推測(cè)原因是煙桿醋液本身成分較復(fù)雜，可能提供了氮素而增加了硝酸還原酶反應(yīng)底物，從而提高了NR活性。

但本試驗(yàn)的結(jié)果存在一個(gè)局限性，即不明確烤煙幼苗的綜合指標(biāo)是否隨著煙桿醋液稀釋倍數(shù)的的增大得到更大程度的改善，或者反而走向轉(zhuǎn)劣趨勢(shì)，即一定的濃度閾值;且目前關(guān)于木醋液對(duì)作物的影響研究多集中于作用效果的探索上，有關(guān)機(jī)理性的探究不夠系統(tǒng)，對(duì)此還需對(duì)其進(jìn)行下一步研究。

本研究以云煙87為試驗(yàn)材料，采用漂浮育苗法，對(duì)烤煙幼苗的生長(zhǎng)及生理特性進(jìn)行了探究，表明以煙桿為原材料制取的醋液對(duì)烤煙幼苗生育有影響，即高濃度處理對(duì)烤煙幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，適宜低濃度對(duì)烤煙幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。

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