6份狼尾草屬菌草的ITS和葉綠體matK序列分析

林雄杰, 范國(guó)成, 林冬梅, 林 輝, 胡菡青, 魯國(guó)東, 林占熺

(1.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，福建 福州 350013)

6份狼尾草屬菌草的ITS和葉綠體matK序列分析

林雄杰1,2, 范國(guó)成2, 林冬梅1, 林 輝1, 胡菡青2, 魯國(guó)東1, 林占熺1

(1.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，福建 福州 350013)

對(duì)來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)、閩清、閩侯和南平等地的6份狼尾草屬菌草的ITS片段和葉綠體matK基因序列進(jìn)行測(cè)定，并用ClustalX 2.0和MEGA 4.1軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).結(jié)果表明，6份菌草的ITS序列長(zhǎng)度均為585 bp，其中變異位點(diǎn)0-3個(gè)，信息位點(diǎn)2個(gè)，遺傳距離為0-0.089，平均遺傳距離為0.022；matK序列長(zhǎng)度為880-881 bp，其中變異位點(diǎn)(信息位點(diǎn))1個(gè)，遺傳距離為0-0.016，平均遺傳距離為0.010.ITS系統(tǒng)樹(shù)結(jié)果顯示6份共菌草聚成四類，其中雜交狼尾草和象草(MQ)聚類在第I類的同一分支，巨菌草和象草聚在第Ⅱ類的不同分支，表明其親緣關(guān)系比較近；matK序列系統(tǒng)樹(shù)結(jié)果除了象草(MQ)外其余5份菌草均聚在了同一分支上，表明葉綠體matK序列無(wú)法將供試的6份菌草區(qū)分開(kāi).

ITS序列;matK基因; 菌草; 序列分析

菌草(JUNCAO)是指適合用于栽培食用菌、藥用菌且具有綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的草本植物.它主要涵括了單子葉植物綱、禾本科的類蘆屬(類蘆)、甘蔗屬(斑茅、甘蔗)、蘆葦屬(蘆葦)、芒屬(五節(jié)芒、荻)、菅屬(菅)、狼尾草屬(象草、巨菌草等)、格蘭馬屬(大米草)、雀稗屬(寬葉雀稗)、香根草屬(香根草)、高梁屬(擬高粱)、玉蜀黍?qū)?玉米)、香茅屬(香茅)、蘆竹屬(蘆竹)，雙子葉植物綱、豆科的苜蓿屬(紫苜蓿)，菊科(串葉草)和蕨類植物門、里白科的芒萁屬(芒萁)等共計(jì)20多個(gè)屬的植物[1].菌草的開(kāi)發(fā)利用不僅解決了食藥用菌生產(chǎn)與林業(yè)生態(tài)平衡之間的“菌林矛盾”及菌業(yè)生產(chǎn)與畜牧業(yè)生產(chǎn)之間爭(zhēng)飼料糧的“菌糧矛盾”，還有效的解決了農(nóng)民就業(yè)和增收問(wèn)題.同時(shí)，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、光合作用效率高的菌草(如巨菌草等)還可作為能源原料用于發(fā)電及作為乙醇、纖維板、紙漿等的工業(yè)原料.菌草因其根量大，網(wǎng)絡(luò)土壤效果好，可以有效固定土壤養(yǎng)分和提高土地蓄水能力，用于水土保持、防風(fēng)固沙環(huán)境修復(fù).

狼尾草屬(Pennisetum)菌草多數(shù)為熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)的一年生或多年生禾本科植物，多數(shù)原產(chǎn)于非洲，其蛋白質(zhì)含量高，可用作香菇、木耳、靈芝、竹蓀等多種食藥用菌的培養(yǎng)料.狼尾草屬菌草的形態(tài)特征均比較相似，隨著菌草技術(shù)在全國(guó)范圍內(nèi)不斷推廣，各地農(nóng)民的廣泛種植，目前品種比較混亂.由于人們對(duì)狼尾草屬菌草的種質(zhì)背景比較模糊，難以區(qū)分種植的品種.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益完善，Hebert et al在2003年提出DNA條碼(DNA barcoding)技術(shù)，它是指用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段(DNA barcode)自身在物種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，它可以對(duì)物種進(jìn)行快速的自動(dòng)鑒定.由于其具有操作簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為生物分類學(xué)研究中的研究熱點(diǎn)和新方向[3].線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome c oxidase Ⅰ, CO Ⅰ)基因已廣泛應(yīng)用于許多鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)[5]和魚(yú)類等動(dòng)物分類和鑒定，已證明是一種較理想的DNA條形碼.但在植物中由于線粒體基因進(jìn)化速度較慢、基因片段變異較小等原因，CO Ⅰ不適合用作條形碼片段[7].學(xué)者們嘗試著從葉綠體基因組和核基因組中尋找理想的DNA條形碼.Kress et al[10]通過(guò)對(duì)整個(gè)被子植物類群取樣研究，從9個(gè)葉綠體基因間隔區(qū)(trnC-ycf6、psbM-trnD、trnK-rps16、trnH-psbA、ycf6-psbM、rp136-rps8、atpB-rbcL、trnv-atpE和trnL-F)和葉綠體基因rbcL及核糖體DNA片段ITS中得出ITS和trnH-psbA是較好的選擇，并建議采用多基因片段的組合對(duì)植物類群的條形碼進(jìn)行鑒定.Newmaste et al在對(duì)肉豆蔻科的毛楠屬(Compsoneura)研究中，從7個(gè)葉綠體DNA片段(accD、UPA、rpoB、matK、rpoC1、rbcL和trnH-psbA)中篩選出較理想的matK和trnH-psbA組合.第三屆DNA條形碼國(guó)際學(xué)術(shù)大會(huì)上，專家們一致建議除rbcL和matK之外，加快進(jìn)化速率較快的ITS和trnH-psbA在陸地植物中的通用性、分辨率和適合程度研究[7].

為了明確菌草研究所選育的若干優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的狼尾屬菌草的分類地位，本研究分別對(duì)采自福建農(nóng)林大學(xué)和閩侯等地的巨菌草、萊牧1號(hào)、象草(Pennisetumpurpureum)等6份狼尾草屬菌草的核ITS序列和葉綠體matK基因序列進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)序列間遺傳距離比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，從分子手段探討它們之間的進(jìn)化關(guān)系，從而為狼尾草屬菌草的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

巨菌草(Pennisetumgianteumlin)、萊牧1號(hào)(Pennisetumsp .Laimu-1)和象草(P.purpureum)、甜象草(PennisetumpurpureumMH)、象草(P.purpureumMQ)和雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum)等優(yōu)質(zhì)菌草的信息詳見(jiàn)表1.樣品采集后放置-28 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

表1 供試菌草樣品信息Table 1 Sample information

1.2 植物基因組DNA的提取

剪取采集好的葉片樣品(約0.5 g)，放置到冷卻的研磨中加入適量液氮迅速研磨成粉末，收集到2 mL離心管中，按植物DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說(shuō)明提取DNA.

1.3 ITS序列及葉綠體matK基因的擴(kuò)增及測(cè)序

ITS和matK序列的擴(kuò)增的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)，反應(yīng)體系為50 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，無(wú)菌水19 μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，32個(gè)循環(huán)[包括94 ℃變性30 s，58 ℃(ITS)或55 ℃(matK)退火30 s，72 ℃延伸1 min]，最后72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠檢驗(yàn)純度和濃度，合格后進(jìn)行回收純化，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序.

1.4 序列比對(duì)及遺傳距離分析

以測(cè)序所得的巨菌草等的ITS序列和matK序列作為參考序列，在NCBI中經(jīng)BLAST搜索并下載狼尾草屬(Pennisetum)的全部ITS序列及matK序列，然后采用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并手工校正，再用Mega 4.1軟件分析其遺傳距離.

表2 ITS和matK引物信息表Table 2 The primer information of ITS and matK

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用Mega 4.1軟件的最大簡(jiǎn)約法(Maximum Parsimony, MP)分別對(duì)得到的ITS序列和matK序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)以1000次自舉分析(Bootstrap)檢測(cè)各分支的置信度.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，6份菌草的ITS序列和matK序列均獲得單一清晰目的條帶，無(wú)非特異性條帶，表明所選擇的兩引物對(duì)6份菌草樣品基因組DNA都有很好擴(kuò)增效果(圖1).

A：ITS序列；B：matk基因序列；Ma：DL2000；Mb：100 bp DNA Ladder；1：巨菌草；2：萊牧1號(hào)；3：象草；4：甜象草(MH)； 5：象草(MQ)；6：雜交狼尾草；7：陰性對(duì)照).圖1 ITS和matK序列PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖譜Fig.1 Electrophoresis of PCR products of ITS and matK sequences

2.2 菌草ITS序列和matK序列分析

將測(cè)序所得的6份菌草ITS序列分別去掉18S和26S序列后，序列長(zhǎng)度均為585 bp，G/C含量為58.29%-58.63%，變異位點(diǎn)0-3個(gè)(表3).用MEGA 4.1軟件分析其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中19條狼尾草屬植物ITS序列間的變異情況，結(jié)果表明，共有578個(gè)保守位點(diǎn)，7個(gè)變異位點(diǎn)(2個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，5個(gè)單突變位點(diǎn))，變異位點(diǎn)比例為1.2%，而信息位點(diǎn)比例達(dá)98.8%，說(shuō)明ITS序列總體變化較小，但具有一定的遺傳信息位點(diǎn)，可用作遺傳分析.

表3 不同菌草ITS和matK序列的長(zhǎng)度及G/C含量Table 3 Length and G /C content of ITS and matK sequences of different JUNCAO

對(duì)6份菌草matK基因序列的測(cè)序結(jié)果表明，序列長(zhǎng)度均為881 bp，G/C含量為33.14%-33.26%，變異位點(diǎn)0-1個(gè)(表3).用MEGA 4.1軟件分析6份菌草植物材料與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中10條狼尾草屬植物matK序列間的變異情況，結(jié)果表明，881個(gè)位點(diǎn)中共有880個(gè)保守位點(diǎn)，1個(gè)變異位點(diǎn)(簡(jiǎn)約信息位點(diǎn))，變異位點(diǎn)比例為0.1%，可見(jiàn)matK序列非常保守，遺傳信息位點(diǎn)較少，不適宜用作狼尾草屬植物遺傳分析.

2.3 菌草ITS序列和matK序列遺傳距離分析

用Mega 4.1軟件對(duì)25種狼尾草屬植物ITS序列的遺傳距離分析結(jié)果如表4所示，它們間的遺傳距離為0-0.089，平均遺傳距離為0.022；其中羽絨草Pennisetumsetaceum(AF019833)與象草(N51)(FJ626357)間的遺傳距離最大，為0.089；供試的象草(MQ)與細(xì)莖雜交狼尾草(FJ626353)和雜交狼尾草(FJ626352)、甜象草(MH)和象草(WK 104)(GQ870179)的遺傳距離最小為0(表4).

表4 不同狼尾草屬植物ITS序列的種間遺傳距離1)Table 4 Genetic distance of ITS sequence among different Pennisetum plants

1)1：P.americanum×P.purpureum閩牧6號(hào)(FJ626366)；2：P.americanum×P.purpureum皇竹草(FJ626364)；3：P.purpureum紅象草(FJ626356)；4：P.purpureum象草(MQ)；5：P.americanum×P.purpureum雜交狼尾草(FJ626352)；6：P.americanum×P.purpureum細(xì)莖雜交狼尾草(FJ626353)；7：P.purpureum象草N51(FJ626357)；8：P.americanum×P.purpureum桂牧1號(hào)(FJ626362)；9：P.americanum×P.purpureum牧草庶(FJ626365)；10：P.sp.萊牧1號(hào)；11：P.purpureum蒺藜草(GQ870178)；12：P.sp. WK104蒺藜草(GQ870179)；13：P.purpureum甜象草(MH)；14：P.sp.巨菌草；15：P.purpureum紫象草(FJ626354)；16：P.americanum×P.purpureum臺(tái)農(nóng)2號(hào)(FJ626359)；17：P.americanum×P.purpureum臺(tái)灣甜草(FJ626363)；18：P.purpureum象草；19：P.americanum×P.purpureum南牧1號(hào)(FJ626360)；20：P.purpureum(AF345232)；21：P.americanum×P.purpureum南牧2號(hào)(FJ626361)；22：P.americanum×P.purpureum雜交狼尾草；23：P.purpureum象草N85 (FJ626358)；24：P.setaceum羽絨草(AF019833)；25：P.alopecuroides狼尾草(FJ766172).

對(duì)16種狼尾草屬植物葉綠體matK序列的遺傳距離分析結(jié)果如表5所示，它們間的遺傳距離為0-0.016，平均遺傳距離為0.010；其中以絨毛狼尾草P.villosum(FN908065)與其余序列間的遺傳距離最大，為0.012-0.016，本研究供試的6份狼尾草屬菌草間的遺傳距離均為0(表5).

2.4 ITS序列和matK序列系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS序列以黍Panicummiliaceum(JX576677)作為外類群，通過(guò)最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建MP樹(shù)，得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2).由圖2可知，25種狼尾草屬植物主要聚為6大類，供試的6份菌草分別聚在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類.其中雜交狼尾草和象草(MQ)聚類在第Ⅰ類的同一分支；巨菌草和象草聚在第Ⅱ類的不同分支；甜象草(MH)和萊牧1號(hào)分別聚類于第Ⅲ和Ⅳ類.巨菌草和雜交狼尾草(FJ626352)聚類在同一分支上.

基于matK基因序列以狗牙根Cynodondactylon(AF144584)作為外類群，通過(guò)最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建MP樹(shù)，得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示.由圖3可知，供試的6份菌草除了象草(MQ)外，其余的均聚類在同一分支.

表5 不同狼尾草屬植物matK序列的種間遺傳距離1)Table 5 Genetic distance matK sequence among different Pennisetum plants

1)1：P.purpureum象草；2：P.sp.萊牧1號(hào)；3：C.purpureus蒺藜草(JQ588783)；4：P.caffrum狼尾草(HE586086)；5：P.setaceum羽絨草(GU135021)；6：P.purpureum甜象草(MH)；7：C.purpureus象草(GU135069)；8：C.purpureus象草(JQ588780)；9：C.purpureus象草(JQ588782)；10：P.americanum×P.purpureum雜交狼尾草；11：C.purpureus象草(GU134990)；12：C.purpureus象草(JQ588781)；13：P.villosum羽絨狼尾草(FN908065)；14：P.sp.巨菌草；15：P.purpureum象草(MQ)；16：C.purpureus象草(JQ588784).

數(shù)字表示各分支自展數(shù)據(jù)支持率，“●” 表示本研究供試植物材料，“*” 表示外類群.圖2 最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 ITS sequences phylogenetic tree using the maximum parsimony method

數(shù)字表示各分支自展數(shù)據(jù)支持率，“●” 表示本研究供試植物材料，“*” 表示外類群.圖3 最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的matK基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The matK gene phylogenetic tree using the maximum parsimony method

3 討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA測(cè)序的得到了蓬勃發(fā)展，已成為比較分子數(shù)據(jù)研究中的一個(gè)主要手段，它為解決物種分類學(xué)、形成與進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域的研究提供了有力的技術(shù)途徑.在高等植物中，核核糖體DNA(nrDNA)的編碼區(qū)序列是高度保守的，序列間的差異主要表現(xiàn)在非編碼區(qū)上(如ITS、ETS及IGS等).nrDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(Internal transcribed spacer)由ITS1、ITS2和5.8S共3部分組成，在被子植物中，由于ITS1和ITS2非編碼區(qū)受外界環(huán)境因素的影響較小，承受的選擇壓力較小，因而進(jìn)化速度較快，核苷酸序列變異較大，且主要是以相互獨(dú)立的點(diǎn)突變?yōu)橹鳎蔀閷僖韵滤降难芯刻峁┹^豐富的信息位點(diǎn)和變異位點(diǎn)等有效信息[16].ITS區(qū)的這種核苷酸序列的高度變異但序列長(zhǎng)度高度保守的特性，可較好的用于識(shí)別那些近緣類群的間隔區(qū)的序列，可有效解決較低的分類階元上(如屬間、種間)的植物系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題.

matK基因是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進(jìn)化速率最快的基因之一，也是最早被用于植物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的基因序列之一.目前，matk序列分析已成功為科、屬級(jí)水平類群內(nèi)部的系統(tǒng)重建提供了大量的信息并獲得較高的支持率.同時(shí)matK序列還成功應(yīng)用于某些類群的種間、種內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化研究[19-21].

本研究通過(guò)測(cè)定6份狼尾草屬菌草ITS序列和葉綠體基因matK序列的，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，ITS序列可以較好的區(qū)分這6份菌草，而matK序列無(wú)法將其區(qū)分開(kāi).根據(jù)構(gòu)建ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，與巨菌草親緣關(guān)系最近的是雜交狼尾草(FJ626352)，它們的ITS序列僅在第216位上存在1個(gè)堿基差異，這與序列測(cè)定結(jié)果是相符的.巨菌草與陳志彤等研究的紫象草(FJ626354)在同一分支，表明它們的親緣關(guān)系較近，推測(cè)可能是它們的近緣種或亞種.供試的萊牧1號(hào)與象草(MH)聚在同一分支，雖然它們的地域差別很大，但這并不影響它們間的親緣關(guān)系，它們間的ITS序列僅在第564位上存在1個(gè)堿基差異.6份菌草在matK序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上除了象草(MQ)外，其余5份均聚在一起，這與之前的遺傳距離分析相吻合，推測(cè)可能是狼尾草屬植物matK序列變異太少，不適合用于種間和種內(nèi)分析.由于狼尾草屬植物基本的染色體數(shù)目，基因組大小或倍性水平多樣性廣泛存在，關(guān)于基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)化趨勢(shì)的仍有一些疑問(wèn)尚待解決[22].因而對(duì)于狼尾草屬植物種屬間親緣進(jìn)化關(guān)系上的判定，需要綜合應(yīng)用多種有效手段，如采用多種DNA條形碼相結(jié)合等進(jìn)行分析，從而使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確、合理.本研究為進(jìn)一步明確供試6份菌草材料的分類地位提供依據(jù).

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Sequence analysis on ITS and chloroplastmatKgene of sixPennisetumJUNCAO

LIN Xiong-jie1,2, FAN Guo-cheng2, LIN Dong-mei1, LIN Hui1, HU Han-qing2, LU Guo-dong1, LIN Zhan-xi1

(1.National JUNCAO Engineering Technology Research Center, Fuzhou, Fujian, 350002, China; 2.Fruit ResearchInstitute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350013, China)

ITS sequences and chloroplastmatKgene of 6PennisetumJUNCAO which were from Fujian Agriculture and Forestry University, Minqing, Minhou and Nanping were sequenced, compared and analyzed with ClustalX 2.0 and MEGA 4.1 softwares and a phylogenetic tree was constructed. It was shown that the length of ITS sequences was 585 bp, including 0 to 3 variable sites and 2 information sites. The genetic distances were 0 to 0.089, averaging 0.022. The length ofmatKgene in 6 JUNCAO was between 880 bp and 881 bp including 1 variable site (information site). The genetic distance was 0 to 0.016, averaging 0.010. Six JUNCAO were clustered into four groups in ITS phylogenetic tree,Pennisetumgianteumlin andPennisetumpurpureum,Pennisetumsp.Laimu-1 andP.purpureum(MQ) were clustered into the group Ⅰ and group Ⅲ, respectively. It was visible from thematKphylogenetic tree that 5 JUNCAO were clustered into the same branch except theP.purpureum(MQ), which indicated that six JUNCAO could not be distinguished by chloroplastmatKsequence.

ITS sequence;matKgene; JUNCAO; sequence analysis

2014-05-28

2014-08-27

國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心開(kāi)放基金項(xiàng)目(JCJJ13001)資助.

林雄杰(1979-)，男，博士，助理研究員.研究方向：分子植物病理學(xué).Email:linxj_019@163.com.通訊作者林占熺(1943-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師.研究方向：菌草學(xué).Email:lzxjuncao@163.com.

Q943.2

A

1671-5470(2015)02-0174-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.012