桉樹根區(qū)土壤中抑草真菌的篩選分離

張 奇, 胡文文, 林曉丹, 李家玉, 梁友誼, 楊 特, 何海斌

(福建農(nóng)林大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350002)

桉樹根區(qū)土壤中抑草真菌的篩選分離

張 奇, 胡文文, 林曉丹, 李家玉, 梁友誼, 楊 特, 何海斌

(福建農(nóng)林大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350002)

通過平板稀釋法分離純化菌株，以萵苣和稗草為受體對候選菌株發(fā)酵液進行抑草潛力評價，得到1株高抑制率的菌株.形態(tài)學觀察結(jié)合18S rDNA測序鑒定為曲霉真菌，命名為FJ-Z10.土壤盆栽試驗結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵液10倍稀釋液對白菜根長和株高的抑制率分別為65.88%和18.97%；對白蘿卜根長和株高的抑制率分別為43.35%和19.55%；對稗草根長和株高的抑制率分別為60.12%和55.00%；對水稻生長沒有明顯影響.該真菌可應用于稻田除草，但不適用于蔬菜田除草.

桉樹; 根區(qū)土壤; 抑草; 真菌

化學除草劑具有作用迅速、使用方便等優(yōu)點,在農(nóng)田雜草防治中發(fā)揮重要作用.但是，化學除草劑的大量和長期使用也帶來了諸如除草劑殘留、雜草抗性增強、農(nóng)田和水體污染等負面作用，給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來不良影響，引起各國政府和研究人員的高度重視[1-4].

微生物除草劑是指在人為控制條件下，選用人工培養(yǎng)繁殖技術獲得的、用于防治雜草的生物制劑，目前以真菌除草劑為主.在雜草與農(nóng)作物親緣關系相近的情況下，由于真菌侵染具有特異性，使用真菌除草劑可以防控雜草而不影響作物的正常生長，可連續(xù)使用.使用微生物除草劑可以避免化學除草劑的非選擇性除草以及長期使用導致的雜草抗性增強，在降低化學除草劑的使用量、保護農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境等方面具有較高的生態(tài)效益和社會效益[5-7].

研究表明，桉樹除了對土壤中的水分和養(yǎng)分具有非常強的競爭力外，還具有較強的化感作用[8-10].近期研究表明，植物化感作用源于植物自身分泌的化感物質(zhì)的直接作用[11-13].同時化感物質(zhì)還會影響根際微生物群落結(jié)構與微生態(tài)系統(tǒng)，從而影響受體植物產(chǎn)生抑制作用的機制[14-18].本研究是根據(jù)植物化感作用對土壤微生物影響的潛在機制，探討從桉樹根區(qū)土壤中篩選具有抑草作用的微生物資源，為微生物除草劑的開發(fā)和應用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

真菌基因組提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix、pMD?18-T Vector購自寶生物工程 (大連) 有限公司.采用真菌專屬培養(yǎng)基即PDA固體培養(yǎng)基(純化培養(yǎng)基)、PDB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)和馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基(分離培養(yǎng)基含1 g·L-1氯霉素和2 mL·L-1慶大霉素)，所有培養(yǎng)基都經(jīng)過滅菌處理.

萵苣、蘿卜、小白菜種子購自福州永榮種子有限公司.Ⅱ優(yōu)航2號水稻種子購自中種集團福建農(nóng)嘉種業(yè)股份有限公司.稗草種子采自福建省福州市福建農(nóng)林大學田間實驗田.

1.2 菌株篩選

按5點取樣法，取福建農(nóng)林大學博學樓與生科樓之間種植的桉樹根部周圍無草區(qū)域的土壤；混勻后，按四分法取樣10 g.菌株的分離參考文獻[19].菌株培養(yǎng)4 d后觀察其生長形態(tài).根據(jù)各菌落形態(tài)特征，挑選生長特征各異的菌株各1株，繼續(xù)用PDA固體培養(yǎng)基(純化培養(yǎng)基)進行純化，重復3次后獲得單一菌株.將上述單一菌株用PDB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)在搖床 (120 r·min-1，28 ℃) 上發(fā)酵10 d，發(fā)酵液用雙層濾紙抽濾后，用于后續(xù)試驗.

1.3 發(fā)酵液抑草能力測試

以萵苣為受體，對發(fā)酵液抑草活性進行測定：在組培皿中加入5 mL的發(fā)酵液，每個組培皿中播入5株剛冒芽的萵苣，以蒸餾水為對照，設置3個重復；組培皿放置于培養(yǎng)箱，28 ℃下培養(yǎng)3 d，測定萵苣的根長和株高[20].以稗草為受體，采用同樣方法進行進一步驗證.選取具有高效抑草作用的菌株進行后續(xù)試驗.

1.4 生長曲線繪制

在操凈臺上，取30 mL已滅菌的PDB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)，裝入50 mL的離心管(已滅菌)；將FJ-Z10菌落用0.8 cm的打孔器在菌落的邊緣打孔，把打下的菌餅放入離心管，做9個菌餅樣品管；樣品管放在28 ℃、160 r·min-1溫控搖床上，24 h后取1管樣品，然后每48 h取1管樣品.將樣品管中發(fā)酵液過濾，菌絲放在40 ℃的烘箱中烘干，冷卻后稱重.重復3次.以天數(shù)為橫軸，以菌體干重為縱軸，繪制生長曲線.

1.5 菌株形態(tài)學初步鑒定

利用高倍顯微鏡觀察菌絲的形態(tài)以及分生孢子的形態(tài)，對FJ-Z10菌株進行形態(tài)學初步鑒定[21].

1.6 菌株18S rDNA測定

利用真菌基因組試劑盒提取純化的FJ-Z10真菌的基因組DNA.根據(jù)真菌鑒定的特異性引物，即上游引物NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物NS6：5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′，對菌株進行18S rDNA測定.目的片段大小約為1300 bp.PCR擴增體系為50 μL，其中2×TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix 25μL、上下游引物(20 μm·mL-1)各1 μL，DNA 1 μL，補充滅菌去離子水至50 μL.反應條件為94 ℃ 4 min預變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94 ℃45 s、55 ℃45 s、72 ℃60 s，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min.取PCR產(chǎn)物5 μL，在1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠上電泳.PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用PCR和雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒.陽性重組質(zhì)粒委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，并將序列信息經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫分析比對.

1.7 篩選菌株的盆栽試驗

盆栽試驗在田間網(wǎng)室的自然環(huán)境下進行.取稻田土自然晾干，碾碎后去除土中的碎石和雜物，過篩.稱取過篩后的細土120 g置于塑料盆(直徑12 cm，高6 cm)中.將已催芽的稗草、水稻、小白菜和白蘿卜的種子5粒播入土壤表層.對FJ-Z10菌株發(fā)酵液進行3個梯度稀釋.處理1：稀釋3倍.處理2：稀釋5倍.處理3：稀釋10倍.分別將各梯度的30 mL稀釋液澆于種子周圍.對照為蒸餾水.每個處理重復3次.每天用噴霧器添加蒸餾水以保持土壤濕潤.種植5 d后測定受體植株的根長和株高.

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件繪制圖表，采用單因素方差分析和Dunnett Two-sided Test 進行顯著性差異分析.對受體生長狀況的影響采用抑制率來評價.受體相對抑制率(IR)的計算公式表示如下：

IR=(1-處理組生長指標/對照組生長指標)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株抑草能力

2.1.1 供試菌液對萵苣生長的影響 經(jīng)分離純化，獲得20個單一菌株.通過室內(nèi)測試試驗，發(fā)現(xiàn)具有抑制作用的菌株有10株；其中2號、3號、7號、8號和10號真菌菌株對萵苣根長和株高的抑制率都達到了100%(圖1、2).

圖1 供試菌液對萵苣根長的影響Fig.1 Effects of fungi ferments on the root length of lettuce

圖2 菌液對萵苣株高的影響Fig.2 Effects of fungi ferments on the shoot length of lettuce

2.1.2 供試菌液對稗草生長的影響 從表1可以看出，對萵苣抑制率高的菌株大多數(shù)對稗草生長的抑制作用大.10號菌株對稗草生長的影響最大，對根長和株高的抑制率分別為100%和82.1%.該菌株命名為FJ-Z10.

2.2 篩選菌株的生物學特性

2.2.1 生長曲線 菌株FJ-Z10的菌體干物質(zhì)重隨時間的變化而變化(圖3).前3 d為菌體生長遲緩期；第9天干物質(zhì)重達到最大，為0.325 g；10 d后菌體的干物質(zhì)重呈直線下降.由此可見10號菌株的生長周期為17 d左右，菌體的發(fā)酵量在9 d左右達到最大.

表1 菌株發(fā)酵液對稗草生長的影響Table 1 Effects of fungi ferments on the growth of barnyard grass

圖3 菌株FJ-Z10的生長曲線Fig.3 The growth curve of strain FJ-Z10

2.2.2 菌株形態(tài)學鑒定 從圖4可以看出，菌株FJ-Z10在PDA培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)2 d,菌落大小中等，菌株表面黑色，邊緣白色，表面丘狀隆起，疏松無同心環(huán)，質(zhì)地呈氈狀，表面無滲出物.鏡檢結(jié)果顯示營養(yǎng)菌絲無橫隔，光滑色淡；孢囊梗直立不分枝；分生孢子頭呈不規(guī)則的圓球形，呈放射狀；分生孢子呈球形.通過對菌落形態(tài)的顯微鏡觀察，根據(jù)文獻[21]可初步確定FJ-Z10菌株屬曲霉科的雜色曲霉.

2.2.3 菌株18S rDNA測定 將測序結(jié)果經(jīng)SeqMan進行序列拼接后，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，結(jié)果表明：其與Aspergillus即曲霉菌屬中的菌株的親源性最近；其與Aspergillusnigerstrain CS 1-1的18S rDNA序列核苷酸同源性高達99%，處于同一遺傳進化分支(圖5).結(jié)合形態(tài)學鑒定，結(jié)果表明其為曲霉屬.

2.3 抑草潛力盆栽試驗

土壤盆栽試驗結(jié)果表明，不同濃度的FJ-Z10發(fā)酵液對白菜、蘿卜和水稻的生長都有較大的抑制作用，且隨著濃度的降低抑制作用減弱.稀釋10倍后的發(fā)酵液對蘿卜根長和株高的抑制率分別為43.35%和19.55%，對白菜根長和株高的抑制率分別為65.88%和18.97%，對水稻的生長沒有影響.不同濃度下的FJ-Z10發(fā)酵液對稗草的抑制作用曲線呈鋸齒狀，但稀釋10倍后的發(fā)酵液對稗草根長和株高的抑制率仍為60.12%和55.00%，因此在此濃度下的發(fā)酵液具有較好的應用價值.

表2 FJ-Z10菌株發(fā)酵液對白菜、蘿卜、稗草和水稻的影響1)Table 2 Effects of fungi ferments of FJ-Z10 strain on the growth of Chinese cabbage, radish, barnyard grass and rice

1)處理1：菌液稀釋3倍.處理2：菌液稀釋5倍.處理3：菌液稀釋10倍.

圖5 菌株FJ-Z10系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of FJ-Z10 strain

3 討論

(1)桉樹的化感物質(zhì)對于植物根系、幼苗的生長和葉片的光合作用有抑制作用，如尾葉桉葉片的提取液對綠豆(PhaseolusaureusRoxb.)和豌豆(PisumsativumL.)的插條的生根有非常強的抑制作用[22].巨尾桉枝葉的水浸提物對水稻(OryzasativaL.)、蕹菜(Ipomoeaaquatica)和菜苔(Brassicaparachinensis)的種子萌芽有不同程度的影響[23].巨尾桉葉片的水抽提物對小麥(TriticumaestivumL.)種子的萌發(fā)和幼苗生長有顯著影響[24].本研究結(jié)果表明桉樹釋放的物質(zhì)能夠有效抑制周圍雜草生長，因此也必然影響桉樹根區(qū)土壤的微生物群落結(jié)構和微生態(tài)系統(tǒng).因此可以從桉樹根際土壤中尋找具有抑草活性的微生物資源并加以開發(fā)利用.

(2)本研究采用馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基，以萵苣和稗草為受體，測定結(jié)果表明桉樹土壤具有較高抑草活性的菌株(FJ-Z10)，并對該菌株進行了生長曲線研究和形態(tài)學與分子生物學鑒定，結(jié)果表明其為曲霉屬.

(3)將FJ-Z10菌株的發(fā)酵液對稗草、蘿卜、白菜和水稻進行土壤盆栽試驗，結(jié)果表明：稀釋10倍后的菌株發(fā)酵液對稗草根長的抑制率為60.12%，株高抑制率為55.00%,這與前人的研究結(jié)果[25]相符；FJ-Z10菌株發(fā)酵液對白蘿卜根長抑制率為43.35%，對株高的抑制率為19.55%；FJ-Z10菌株的發(fā)酵液對小白菜根長抑制率為65.88%，對株高抑制率為18.97%；它對水稻的生長沒有明顯影響.本研究從桉樹根區(qū)土壤中分離到1株具有強抑草作用真菌菌株，該真菌可應用于稻田除草，但不適合于蔬菜地的除草.對菌株進行抑草物質(zhì)分析以明確其中主要抑草物質(zhì)及其機理，還有待進一步研究.

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(責任編輯:葉濟蓉)

Isolation of a high herbicidal fungal strain from rhizospheric soils ofEucalyptus

ZHANG Qi, HU Wen-wen, LIN Xiao-dan, LI Jia-yu, LIANG You-yi, YANG Te, HE Hai-bin

(College of Life Sciences/Agroecological Institute, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

One microbial strain was successfully isolated and purified from the rhizospheric soils by plate dilution method with fungi medium, cooperating with laboratory bioassay using lettuce and barnyard grass as target plants. This strain, named FJ-Z10, was identified as fungusAspergillusby the morphology and 18S rDNA sequences. In pot culture experiments, the inhibitory rates of a 10-fold dilution of this strain ferments on root length and plant height were 65.88% and 18.97% of Chinese cabbage, 43.35% and 19.55% of radish, and 60.12% and 55.00% of barnyard grass, respectively. However, there was no significant effect on rice growth. The results demonstrated that this fungal strain could be used to control agricultural weeds but was not suitable to control vegetable weeds.

Eucalyptus; rhizospheric soil; herbicidal activity; fungi

2014-10-11

2015-01-21

國家自然科學基金資助項目(31070447、31370380);福建省自然科學基金資助項目(2012J01077);福建省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(1112C1243).

張奇(1989-)，男，碩士研究生.研究方向：化學生態(tài)學.Email:1185458937@qq.com.通訊作者何海斌(1965-)，男，教授,博士，博士生導師.研究方向：植物化學與化學生態(tài)學.Email:alexhhb@163.com.

Q939

A

1671-5470(2015)02-0159-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.009