杉木炭疽病拮抗菌AM53菌劑的研制及其林間防效

李冬琴, 譚益民, 路宗巖, 周國英

(中南林業(yè)科技大學經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

杉木炭疽病拮抗菌AM53菌劑的研制及其林間防效

李冬琴, 譚益民, 路宗巖, 周國英

(中南林業(yè)科技大學經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

通過量筒法篩選助劑研制生防菌AM53的水分散性粒劑，并測定其林間防治效果.結(jié)果表明:水分散粒劑的最佳配方為：3.5%十二烷基硫酸鈉(潤濕劑)，5%木質(zhì)素磺酸鈉(分散劑)，4%硫酸銨(崩解劑)，2%聚乙二醇(粘結(jié)劑)，加水量16%-20%，高嶺土補足100%.貨架期試驗結(jié)果表明，該粒劑常溫下至少能貯存3-4個月.林間防治試驗結(jié)果表明，AM53菌劑對杉木炭疽病有較好的防治效果.

杉木； 炭疽菌; 拮抗菌; 菌劑; 防治效果

Development and forest control of antagonistic bacteria AM53 against

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方主要速生豐產(chǎn)用材樹種，杉木炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是杉木栽培區(qū)的主要病害，在低山、丘陵地區(qū)人工幼林常成片、大面積發(fā)生[1].目前已報道的杉木炭疽病的防治措施大多為營林措施和化學防治.人們關(guān)注的重點逐漸轉(zhuǎn)向安全無污染的無公害生物農(nóng)藥[2-3].微生物源農(nóng)藥的研發(fā)與應(yīng)用已引起人們的高度重視[4-5].研究[6-7]表明，內(nèi)生細菌對植物病原菌有一定的抑制效果，如對蔬菜立枯病菌、香蕉炭疽病菌等.本研究從杉木根際土壤中分離到1株對杉木炭疽病具有良好拮抗作用的生防菌AM53，研制出該菌株的水分散粒劑，并測定其對杉木炭疽病的林間防治效果，為開發(fā)綠色農(nóng)藥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotfichumgloeosporioides)，編號CSUFTCC F0101；拮抗菌為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，編號AM53.病原菌和拮抗菌均為中南林業(yè)科技大學森林保護教研室分離、鑒定、保藏的菌種.

1.1.2 載體、助劑和水 載體為高嶺土、膨潤土和硅藻土.助劑有十二烷基硫酸鈉、皂角粉、茶枯粉、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、三聚磷酸鈉、氯化鈣、硫酸銨、氯化鈉、聚乙二醇、聚乙烯醇、可溶性淀粉.水為無菌水、標準硬水和蒸餾水.

1.1.3 儀器 干燥箱(101A-2)由上海市實驗儀器總廠提供；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HWS智能型)由寧波江南儀器廠提供；多功能漩渦混合器(Vortex Genie 2)由美國科學工業(yè)公司提供；精密pH酸度計(PHS-3B)由上海宇隆儀器有限公司提供；全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X280)由太倉市華美生化儀器廠提供；紫外-可見分光光度計(722S)由上海著華科技儀器有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 載體、助劑生物相容性的測定 將供試載體分別按照6%(0.06 g·mL-1)的比例與蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基混合均勻，倒入培養(yǎng)皿中備用.取0.1 mL原藥(菌體濃度>8×1010cfu·mL-1)，制成10-3、10-4、10-5稀釋液，涂布于含不同載體組分的培養(yǎng)基上，對照為不含載體成分的蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基，每個處理重復(fù)3次.28 ℃培養(yǎng)2 d，記錄各培養(yǎng)皿中生防菌的菌落數(shù).

供試助劑的生物相容性測定方法與上述相同，處理1濃度為250 μg·mL-1，處理2濃度為500 μg·mL-1.

1.2.2 助劑用量的篩選 將載體與原藥(AM53搖瓶發(fā)酵液，菌體濃度>8×1010cfu·mL-1)按7∶1的質(zhì)量比配成母粉[8]備用.將潤濕劑分別以2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%的質(zhì)量分數(shù)與載體、原藥混合，根據(jù)潤濕時間確定潤濕劑用量.潤濕時間的測定根據(jù)國家標準GB/T 5451-2001[9]進行.將分散劑以4%、4.5%、5%、5.5%、6%的質(zhì)量分數(shù)分別與載體、原藥、潤濕劑混合，根據(jù)分散性、崩解時間、懸浮性確定分散劑用量.分散性測定采用量筒混合法[10-11]，崩解時間測定采用刻度量筒法[8]，懸浮性測定根據(jù)國家標準GB/T 14825-2006[12]進行.將崩解劑以2%、3%、4%、5%、6%的質(zhì)量分數(shù)分別與載體、原藥、潤濕劑、分散劑混合，根據(jù)崩解時間和懸浮性確定崩解劑用量.將粘結(jié)劑以1%、2%、3%、4%的質(zhì)量分數(shù)與載體、原藥、潤濕劑、分散劑、崩解劑混合，根據(jù)崩解時間、成粒率、顆粒強度確定粘結(jié)劑用量.成粒標準的粒徑為30-60目.成粒率(%)=(成粒樣品質(zhì)量/樣品總質(zhì)量)×100%.將蒸餾水按10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%的比例加入，攪拌均勻，分別計算成粒率.

1.2.3 菌劑貨架期的測定 將原藥、載體、潤濕劑、崩解劑、分散劑按一定比例混合均勻，研磨粉碎后加入一定量水和粘結(jié)劑進行捏合造粒，再進行擠壓和干燥，篩分后得到藥劑成品.

將菌劑分裝在50 mL三角瓶中，分別于4 ℃和室溫條件下保存.在試驗開始、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天分別測定菌劑中的活菌含量及其對杉木炭疽病菌的抑菌活性.采用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，采用對峙平板法測定抑菌活性.測定時取1 g菌劑定溶至100 mL，搖勻，進行活菌數(shù)和抑菌活性的測定.每處理3次重復(fù).

1.2.4 菌劑防效的林間試驗 試驗分為以下4個處理：處理一為菌劑100倍稀釋液；處理二為菌劑500倍稀釋液；處理三為菌劑1000倍稀釋液；處理四為75%多菌靈500倍液.對照為清水.試驗設(shè)3次重復(fù).在杉木幼林地采用隨機區(qū)組設(shè)計，共15個小區(qū)，每小區(qū)16株杉木，小區(qū)間設(shè)保護行.用噴霧器施藥，共施藥4次，間隔15 d.處理前調(diào)查1次，并在最后1次處理10 d后再調(diào)查1次，共調(diào)查5次.每小區(qū)隨機選5株調(diào)查所有枝梢，并記錄整株發(fā)病嚴重度，計算防治效果.杉木炭疽病病情的分級標準參照文獻[1].

2 結(jié)果與分析

表1 不同載體對AM53芽孢萌發(fā)的影響1)Table 1 Effects of different carriers on the germination of AM53

1)不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

2.1 載體對AM53芽孢萌發(fā)的影響

將供試載體分別與蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基混合均勻，涂布原藥培養(yǎng)2 d后的菌落數(shù)見表1.從表1可看出，以高嶺土作載體時拮抗菌AM53菌落數(shù)達到6.68×1010cfu·mL-1，芽孢存活率為78.40%，效果最佳，故將高嶺土作為菌劑載體.

將供試助劑與蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基混合，涂布原藥培養(yǎng)2 d后活菌數(shù)見表2、3.由表2、3可以看出，分別加入十二烷基硫酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、聚乙二醇、硫酸銨的培養(yǎng)基中的生防菌AM-53芽孢萌發(fā)數(shù)與對照組的較接近，因此將這4種物質(zhì)作為下一步試驗的配方.

表2 不同助劑(濃度為250 μg·mL-1)對AM-53芽孢萌發(fā)的影響1)Table 2 Effects of different auxiliaries (250 μg·mL-1) on the germination of AM53

1)不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

表3 不同助劑(濃度為500 μg·mL-1)對AM-53芽孢萌發(fā)的影響1)Table 3 Effects of different auxiliaries (500 μg·mL-1) on the germination of AM53

1)不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

表4 十二烷基硫酸鈉的篩選結(jié)果1)Table 4 Result of the selection of sodium dodecyl sulfate

1)不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

2.2 助劑用量的選擇

2.2.1 潤濕劑 從表4可以看出，潤濕時間隨十二烷基硫酸鈉的用量的增加而減少.十二烷基硫酸鈉的用量為2.5%-3.5%時潤濕時間變化明顯；十二烷基硫酸鈉用量為3.5%-4.5%時潤濕時間變化緩慢.表明十二烷基硫酸鈉含量為3.5%時效果顯著，此時潤濕時間為88 s.綜合考慮效果、價格等各方面因素，十二烷基硫酸鈉用量為3.5%時較為合適.

2.2.2 分散劑 從表5可以看出，木質(zhì)素磺酸鈉崩解時間隨其用量的增加而縮短.木質(zhì)素磺酸鈉用量為4%-5%時崩解時間變化明顯，用量超過5%時崩解時間變化趨于緩慢.說明木質(zhì)素磺酸鈉用量為5%時效果明顯.綜合考慮效果、價格等各個方面因素，分散劑選用5%木質(zhì)素磺酸鈉比較適合.

2.2.3 崩解劑 由表6可以看出，硫酸銨用量為2%-4%時崩解時間變化明顯，用量為4%-6%時崩解時間變化緩慢.由此可見硫酸銨的用量為4%時，崩解作用顯著.綜合考慮各種因素，硫酸銨用量為4%時較為合適.

表5 木質(zhì)素磺酸鈉的篩選結(jié)果1)Table 5 Result of the selection of sodium lignosulfonate

1)“++”表示藥品在底部的沉積厚度在5 mm以下，“+”表示沉積厚度為5-6 mm.不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

表6 硫酸銨的篩選結(jié)果1)Table 6 Result of the selection of (NH4)2SO4

1)“++”表示藥品在底部的沉積厚度在5 mm以下，“+”表示沉積厚度為5-6 mm.不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

2.2.4 粘結(jié)劑 由表7可以看出，聚乙二醇崩解時間隨其用量的增加而增加，且聚乙二醇用量為2%時就能達到成粒要求，由此確定聚乙二醇最佳用量為2%.

表7 聚乙二醇的篩選結(jié)果1)Table 7 Result of the selection of polyethylene glycolr

1)不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

2.2.5 加水量 由圖1可知，成粒率隨加水量的增加而增加，加水量低于16%時，成粒率增長迅速，加水量高于20%時增長速度緩慢.綜合考慮成粒率、產(chǎn)品質(zhì)量、物料等因素，將加水量控制在16%-20%比較合適.

2.3 菌劑的抑菌活性及貨架期

水分散粒劑的芽孢存活率見圖2，抑菌活性隨時間的變化見圖3.從圖3可以看出，第12天菌劑的抑菌率仍在70%以上，在不同的保存環(huán)境下，該菌劑的芽孢存活率和拮抗活性均相差不大，因此該生防菌劑可以在常溫下保存.

圖1 加水量與成粒率的關(guān)系Fig.1 Relationship between water and the rate of granule

圖2 不同保存條件下的活菌數(shù)與時間的關(guān)系Fig.2 Relationship between the number of bacteria under different storage conditions and time

圖3 不同保存條件下的抑菌率與時間的關(guān)系Fig.3 Relationship between the bacteria resistibility under different storage conditions and time

2.4 AM53菌劑的林間防治效果

將生防菌劑AM53應(yīng)用于湖南攸縣杉木栽培區(qū)，第4次用藥10 d后(即第70天)，100倍菌劑稀釋液的防治效果達76.10%，菌劑100倍稀釋液和500倍稀釋液的防治效果均比500倍75%多菌靈的好(表8).

表8 AM53菌劑對杉木炭疽病的林間防治效果1)Table 8 Effect of AM53 on C.gloeosporioides in glade test

1)不同字母表示差異顯著(P<0.05,n=3).

3 討論

本研究通過生物相容性、抑菌活性及貯存時間的測定，以及對潤濕性、分散性、懸浮性、崩解性的評價，確定該生防菌劑的最佳配方為：3.5%十二烷基硫酸鈉(潤濕劑)，5%木質(zhì)素磺酸鈉(分散劑)，4%硫酸銨(崩解劑)，2%聚乙二醇(粘結(jié)劑)，加水量16%-20%，高嶺土補足100%.菌劑貯存時間的測定結(jié)果表明，AM53菌劑在常溫下能貯存3-4個月.林間防治試驗結(jié)果表明，AM53菌劑對杉木炭疽病有較好的防治效果，第4次施藥后500倍稀釋液的防治效果可達到74.12%，略高于500倍75%多菌靈.

本研究制備水分散粒劑工藝流程簡單，在實際應(yīng)用中有一定參考價值，但是篩選助劑方法比較繁瑣，有待進一步簡化.

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(責任編輯:葉濟蓉)

Colletotrichumgloeosporioideson Chinese fir

LI Dong-qin, TAN Yi-min, LU Zong-yan, ZHOU Guo-ying

(Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Ministry of Education,Central South University of Forestry and Technology, Changsha， Hunan 410004 ， China)

The water dispersible granule (WDG) with strain AM53 was developed by measuring cylinder method, and the control effect of forest on anthracnose disease was also determined. The optimal WDG formulation was as follows: 3.5%SDS+5%sodium lignosulfonate+4%(NH4)2SO4+2%PEG. The granule could be preserved at least for 3-4 months at normal temperature. The result showed that the forest control effect of antagonistic bacteria AM53 onColletotrichumgloeosporioideswas good.

Chinese fir；Colletotrichumgloeosporioides; antagonistic bacteria; microbial inoculum; control effect

2014-04-16

2014-10-20

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費資助項目(201004014).

李冬琴(1990-),女,碩士.研究方向:森林微生物.Email:lee20090184@sina.com.通訊作者周國英(1966-),女，教授,博士生導師.研究方向:森林微生物.Email:gyzhou2118@yahoo.com.cn.

S767.1+6

A

1671-5470(2015)02-0154-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.008