一株分離自鈾礦土壤的蘇云金芽孢桿菌的鑒定

張巧鈴, 邱淑惠, 張永嶸, 黃天培

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

一株分離自鈾礦土壤的蘇云金芽孢桿菌的鑒定

張巧鈴, 邱淑惠, 張永嶸, 黃天培

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

從新疆某鈾礦廠土樣中分離出1株芽孢桿菌，初步確定為蘇云金芽孢桿菌(Bt)，命名為BRC-ZYR3.該菌株含有3種cry1類基因(cry1Ba、cry1Bb、cry1Be/1Bf)和2種cry9類基因(cry9Ca和cry9Da).Bt BRC-ZYR3可產(chǎn)生5種殺蟲晶體蛋白，分別為130、70、50、30和25 ku.此外，該菌株能耐受25 mg·L-1Cr(VI)，并在72 h內(nèi)將其還原至3.8 mg·L-1.

Cr(VI); 蘇云金芽孢桿菌; PCR-RFLP; SDS-PAGE

重金屬被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和人們的日常生活，與此同時，重金屬污染成為了全球面臨的一個重要問題[1].我國重金屬污染事故頻發(fā)：2011年云南曲靖鉻渣非法傾倒、2012年廣西龍江河的鎘污染、2013年湖南“鎘大米事件”等.傳統(tǒng)的重金屬修復(fù)技術(shù)包括物理化學(xué)法、農(nóng)業(yè)化學(xué)調(diào)控法以及垃圾堆肥法等，存在成本高、易產(chǎn)生二次污染、破壞土壤理化性質(zhì)等問題，難以大面積推廣應(yīng)用[2].經(jīng)過多年的探索和研究，用微生物修復(fù)技術(shù)治理重金屬污染被看作是一個有效策略[3].

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是具有殺蟲活性的革蘭氏陽性細菌，在自然界中分布廣泛.其最大的特點是在芽孢形成過程中能夠產(chǎn)生1個或多個伴孢晶體，亦稱殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)[4].Bt殺蟲劑對人畜無害、不污染環(huán)境，因而在生物防治中占有極其重要的地位[3].土壤作為微生物生存的最佳介質(zhì)，也是Bt分布最為豐富的生境，從不同生態(tài)環(huán)境的土壤樣品中分離、篩選及開發(fā)利用天然的Bt菌株，始終是一項重要的研究任務(wù)[5].本試驗從新疆某鈾礦廠采集的土樣中分離得到1株Bt菌株，進一步利用PCR-RFLP鑒定體系和SDS-PAGE技術(shù)研究該菌株的殺蟲晶體蛋白基因類型和表達情況，并分析其對Cr(VI)的還原能力及耐受性，以期為利用Bt進行生物防治的同時有效治理Cr(VI)污染提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 土樣采集與菌株分離

土樣來源于新疆某鈾礦廠，采集其土表以下3 cm左右的土壤，裝入采集袋中備用.采用醋酸鈉—抗生素篩選法[6]篩選菌株.

1.2 培養(yǎng)基、試劑與酶

配制液體LB、固體LB、固體1/2 LB培養(yǎng)基以及生理生化培養(yǎng)基；配制堿性復(fù)紅染色液、1%酸性復(fù)紅水溶液、5% α-萘酚乙醇、1.6%溴甲酚紫、20%尿素溶液、5% FeCl3水溶液、40% KOH溶液、Lugco碘液.PCR所用試劑和限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司.

1.3 顯微樣品制備與晶體觀察

將菌株接種于1/2 LB培養(yǎng)基上，每隔6-8 h肉眼觀察菌落形態(tài)，取樣并按常規(guī)的石炭酸復(fù)紅染色方法進行染色，觀察有無營養(yǎng)體、孢子囊、芽孢、伴孢晶體生成，共觀察3 d.

1.4 主要生理生化指標的鑒定

典型生理生化指標的測定，包括各種糖的利用、淀粉水解、乙酰甲基甲醇(V.P)反應(yīng)、脲酶水解、七葉靈利用、卵磷脂酶、精氨酸脫羧酶、菌膜形成[7].

1.5 Btcry基因型的鑒定

以Bt質(zhì)粒DNA作為PCR模板，合成10對cry1-cry10基因通用鑒定引物，利用PCR-RFLP對該菌株的cry基因型進行鑒定[8].

1.6 Bt殺蟲晶體蛋白的分析

收集Bt孢晶混合物，進行SDS-PAGE電泳[9].

1.7 對Cr(VI)還原能力及耐受性分析

向含有25 mg·L-1Cr(VI)的培養(yǎng)基中接種Bt菌株，每隔12 h取樣，測量體系中剩余Cr(VI)的濃度，以分析Bt對Cr(VI)的還原情況[10].將Bt菌株適量接種于不同Cr(VI)濃度(0、25、50、75、100 mg·L-1)的培養(yǎng)基中，6 h后取樣，測定Cr(VI)的濃度，以分析Bt對Cr(VI)的耐受性[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

源自鈾礦的土壤樣品經(jīng)醋酸鈉—抗生素分離法處理后，挑取到1個類似Bt的菌落，將其接種到1/2 LB固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，菌落呈乳白色且有粗糙褶皺，邊緣不整齊，單菌落呈圓盤狀，在1/2 LB平板培養(yǎng)時在菌苔邊緣出現(xiàn)明顯的輻射狀；液體培養(yǎng)時，搖勻后均勻渾濁，無明顯的顆粒狀；制片時菌斑亦均勻平整，未見顆粒狀；經(jīng)復(fù)紅染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其營養(yǎng)體呈桿狀，菌端鈍圓；孢子囊呈桿狀，比營養(yǎng)體稍膨脹，囊內(nèi)一端為芽孢，另一端有伴孢晶體；當(dāng)孢子囊破裂時釋放出芽孢和晶體，芽孢呈透明卵圓形，伴孢晶體呈紫色菱形(圖1).根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)分析，將該菌株初定為Bt，并命名為BRC-ZYR3.

A：營養(yǎng)期；B：孢子囊期；C：裂解期.圖1 光學(xué)顯微鏡下的Bt菌株BRC-ZYR3Fig.1 Morphology of Bt BRC-ZYR3 observed under the optical microscope

2.2 菌株的生理生化鑒定

對分離株BRC-ZYR3的典型生理生化指標進行測定.結(jié)果表明，該菌株對各種糖的利用、淀粉水解、乙酰甲基甲醇(V. P)、脲酶水解、七葉靈利用、卵磷脂酶、精氨酸脫羧酶、菌膜形成均呈陽性反應(yīng)，該鑒定結(jié)果與伯杰氏細菌鑒定手冊中Bt的鑒定內(nèi)容[11]相符，確認BRC-ZYR3為Bt.

2.3 菌株cry基因型的鑒定

以分離到的菌株BRC-ZYR3質(zhì)粒DNA作為模板，利用PCR-RFLP方法對BRC-ZYR3的cry基因型進行鑒定.其中，由通用引物K5un2/K3un2擴增出約1.6 kb的目的條帶，說明菌株BRC-ZYR3含有cry1/cry7/cry9型基因.對擴增產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶XbaⅠ/PstⅠ雙酶切分析，通過比對，初步確定該菌株所含cry1型基因為cry1Ba、cry1Bb和cry1Be/1Bf組合，所含cry9型基因為cry9Ca和cry9Da組合，不含cry7型基因(圖2).

2.4 菌株伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析結(jié)果表明，菌株BRC-ZYR3的晶體主要由分子質(zhì)量為130、70、50、30和25 ku的蛋白組成(圖3).研究表明，通常cry1/cry7/cry9型基因編碼的蛋白為130 ku[12]，說明PCR-RFLP分析正確.

M：DNA分子質(zhì)量標準；1：以K5un2和K3un2為引物，以Bt BRC-ZYR3的質(zhì)粒為模板擴增的cry1/cry7/cry9基因PCR產(chǎn)物；2：以Bt BRC- ZYR3的cry1/cry7/cry9基因PCR產(chǎn)物為模板，用PstⅠ和XbaⅠ雙酶切得到的片段.圖2 利用PCR-RFLP技術(shù)分析Bt BRC-ZYR3菌株的cry基因型Fig.2 Detection of cry gene types of Bt BRC-ZYR3 with PCR-RFLP M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：Bt BRC-ZYR3 ICPs.圖3 Bt BRC-ZYR3殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of Bt BRC-ZYR3 ICPs

2.5 菌株Cr(VI)還原能力及耐受性分析

Bt BRC-ZYR3可耐受25 mg·L-1Cr(VI)，72 h后，Bt BRC-ZYR3可將Cr(VI)濃度降至3.8 mg·L-1.

3 討論

本研究通過醋酸鈉—抗生素法對含鈾礦的土壤樣品進行分離，獲得1株菌株，其形態(tài)和主要生理生化指標與Bt相符，被命名為BRC-ZYR3.

Bt作為目前應(yīng)用最為廣泛的一種微生物殺蟲劑，其殺蟲活性與cry基因編碼的殺蟲晶體蛋白的特異性密切相關(guān)[13].Bt不同亞種的殺蟲晶體蛋白可由單一或多個不同大小級別的毒蛋白組成[14].本研究采用PCR-RFLP鑒定體系對BRC-ZYR3進行cry基因型鑒定.結(jié)果表明：該菌株含有cry1Ba、cry1Bb、cry1Be/1Bf、cry9Ca和cry9Da5種cry基因.據(jù)報道，cry1類毒素蛋白對鞘翅目昆蟲具有毒殺活性，其中cry1Ba的毒素蛋白對小菜蛾表現(xiàn)出較高的活性；cry9類毒素蛋白對甜菜夜蛾有高毒力[15-16].比較SDS-PAGE結(jié)果與cry基因型發(fā)現(xiàn)，該菌株表達約130 ku的晶體蛋白，這與PCR-RFLP檢測含有cry1和cry9基因表達的蛋白大小一致.此外，SDS-PAGE結(jié)果顯示，菌株還表達70、50、32和25 ku的蛋白，而PCR-RFLP未檢測出相應(yīng)大小的蛋白.通常大小為70 ku的蛋白是cry2類產(chǎn)物，50 ku的蛋白可能是Cry2Ab的降解產(chǎn)物，也可能是其他未知cry型基因編碼產(chǎn)物，對其有待進一步研究.由此可知，PCR-RFLP結(jié)果不能完全反映這些基因在菌株中的表達情況，不足以證明菌株的殺蟲效果，而SDS-PAGE結(jié)果更能明確Bt菌株可能的殺蟲效果[17].

近年來，微生物治理重金屬污染備受重視，即利用原土壤中的土著微生物對特定重金屬吸收、沉積，從而修復(fù)被污染土壤[18].本研究表明，Bt BRC-ZYR3可耐受25 mg·L-1Cr(VI)，且72 h后，可將其還原至3.8 mg·L-1.本實驗室前期研究表明，從源自水樣、土壤、植物、動物糞便、食品、昆蟲和飲料的Bt菌株中都能篩選出快速還原Cr(VI)的菌株[3]，表明Bt有望在被作為生物農(nóng)藥應(yīng)用的同時，治理Cr(VI)污染，這是值得深入研究的一個方向.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Identification of aBacillusthuringiensisstrain isolated from uranium soil

ZHANG Qiao-ling, QIU Shu-hui, ZHANG Yong-rong, HUANG Tian-pei

(Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agricultureand Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

A soil sample was collected from a factory of uranium-mine in Xinjiang Province, China. A new isolate, designated as BRC-ZYR3, was identified asBacillusthuringiensis(Bt). The results showed that Bt BRC-ZYR3 harboredcry1Ba,cry1Bb,cry1Be/1Bf,cry9Caandcry9Dagenes and encoded 130, 70, 50, 30 and 25 ku insecticidal crystal proteins (ICPs). And Bt BRC-ZYR3 resistant to 25 mg·L-1Cr(VI) could reduce Cr(VI) to 3.8 mg·L-1.

Cr(VI);Bacillusthuringiensis; PCR-RFLP; SDS-PAGE

2014-01-27

2014-04-18

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2011AA10A203)；國家自然科學(xué)基金(31201574、31071745)；福建省教育廳項目“教育廳高校領(lǐng)軍人才”(k8012012a).

張巧鈴(1988-)，女，碩士研究生.研究方向：微生物分子生物學(xué).Email：qiaoling068@163.com.通訊作者黃天培(1979-)，男，副研究員，博士.研究方向：微生物藥物.Email：tianpeihuang@126.com.

Q89

A

1671-5470(2015)02-0131-04

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.004