福州地區(qū)豨薟黃脈病病原的分子鑒定

張 潔, 林文武, 朱重慶, 吳錦鴻, 陳曉敏, 章松柏, 吳祖建

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

福州地區(qū)豨薟黃脈病病原的分子鑒定

張 潔, 林文武, 朱重慶, 吳錦鴻, 陳曉敏, 章松柏, 吳祖建

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

為明確引起福建省福州地區(qū)豨薟上黃脈癥狀的病原，利用PCR技術(shù)，從3個(gè)樣品上均擴(kuò)增到雙生病毒約500 bp的特異片段，選擇病毒分離物Fz02進(jìn)行全序列測(cè)定.結(jié)果表明：Fz02 DNA-A全長(zhǎng)2771 nts，具有典型的雙生病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征，與豨薟黃脈病毒廣州分離物(SbYVV-Gz01)同源性最高，達(dá)93.4%.利用設(shè)計(jì)的衛(wèi)星分子的特異性引物，在病毒分離物Fz02中擴(kuò)增到betasatellite分子(Fz02β).Fz02β全長(zhǎng)1359 nts，與SbYVV廣東分離物(GD13)伴隨的betasatellite同源性最高，為85.3%.系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)表明，F(xiàn)z02與SbYVV各分離物聚類(lèi)為一個(gè)大分支.此外，SbYVV序列變異較大.

雙生病毒; 豨薟黃脈病毒; 豨薟; 序列變異

雙生病毒(Geminivirus)是一類(lèi)具有孿生顆粒形態(tài)的植物環(huán)狀單鏈DNA病毒，病毒粒子的大小約為18 nm×30 nm，無(wú)包膜，由昆蟲(chóng)介體以持久性方式傳播，大多侵染寄主植物的韌皮部組織.雙生病毒既有單組份也有雙組份，有的單組份還伴隨衛(wèi)星betasatellite分子(之前被稱(chēng)為DNAβ)，并與之形成雙生病毒/betasatellite病害復(fù)合體.近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易活動(dòng)的頻繁，雙生病毒的傳播愈演愈烈，對(duì)多種糧食及經(jīng)濟(jì)作物諸如煙草、番茄、棉花以及大豆等造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1].

雜草分布廣泛，適應(yīng)繁殖力強(qiáng)，是雙生病毒的重要中間寄主，對(duì)雙生病毒的傳播擴(kuò)散、重組變異進(jìn)化極其重要.近年來(lái)，越來(lái)越多的雜草被雙生病毒侵染[2-5].豨薟(Siegesbeckiaorientalis)是亞洲地區(qū)常見(jiàn)的雜草，可以在農(nóng)閑和作物輪作期間繁殖病毒.在我國(guó)，豨薟上已經(jīng)檢測(cè)到的雙生病毒有豨薟黃脈病毒(Siegesbeckiayellowveinvirus,SbYVV)[2,5]、廣西豨薟黃脈病毒(SiegesbeckiayellowveinGuangxivirus,SbYVGxV)[6]、中國(guó)番木瓜曲葉病毒(PapayaleafcurlChinavirus,PaLCCNV)[5]，以及中國(guó)番茄黃曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus,TYLCCNV)[7].據(jù)報(bào)道，PaLCCNV和TYLCCNV已經(jīng)對(duì)番木瓜、番茄、煙草等經(jīng)濟(jì)作物造成危害[8-10]，因此豨薟上的雙生病毒應(yīng)引起足夠重視.本研究對(duì)福建省福州地區(qū)豨薟黃脈病病原進(jìn)行鑒定，并對(duì)其核苷酸序列變異進(jìn)行分析，以明確其病毒類(lèi)型和特性.

1 材料與方法

1.1 病毒分離物

圖1 表現(xiàn)黃脈癥狀的豨薟Fig.1 Yellow vein symptoms in Siegesbeckia orientalis

病毒分離物于2012年11月采自福州地區(qū)的豨薟樣品，病株均表現(xiàn)為黃脈癥狀(圖1).

1.2 植物總DNA提取

采用何瑋毅等[11]報(bào)道的改良CTAB法提取豨薟葉片中的總DNA.

1.3 DNA-A全長(zhǎng)基因組的克隆和序列測(cè)定

利用雙生病毒DNA-A保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物PA/PB[12]擴(kuò)增得到大約500 bp的DNA-A部分序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行純化，連接于pMD18-T載體(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用M13引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選后送交上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序.然后根據(jù)測(cè)得的序列設(shè)計(jì)背向引物Sig-Full-F(5′-GCCCTGATGTTCCTCGTGGT-3′)/Sig-Full-R(5′-GTTGGTGACAAGGACAGTTGGG-3′)，用來(lái)擴(kuò)增病毒DNA-A全長(zhǎng)序列，克隆方法同500 bp部分序列.本研究中PCR均使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransStart FastPfu DNA Polymerase.

1.4 衛(wèi)星betasatellite分子的檢測(cè)

利用betasatellite特異引物beta01/beta02[13]試圖擴(kuò)增衛(wèi)星全長(zhǎng)片段，但一直未能得到大小為1.3 kb的特異性片段.根據(jù)DNA-A序列同源性分析，利用SbYVV分離物(GD13、GD24、GD27)所伴隨的betasatellite保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)背向引物betaFz02-F(5′-AGCTACGCCGGAGCTTAGCTC-3′)/betaFz02-R(5′-AAGGCTGCTGCGTAGCGTAG-3′)，擴(kuò)增得到約1.3 kb的特異性片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化克隆后測(cè)序，方法同1.3.

1.5 病毒基因組序列分析

利用DNAStar分析軟件(DNAStar Inc., Madison, WI, USA)中的MegAlign程序及Clustal V方法比較序列相似性.系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)的構(gòu)建采用MEGA 5.0的鄰近相連法(Neighbor-joining).通過(guò)NCBI BLAST查找序列相似性.采用Simplot version 3.2軟件分析序列重組性.采用DnaSP version 5.10.01軟件分析核苷酸序列變異程度.ORF預(yù)測(cè)通過(guò)在線軟件ORF Finder程序進(jìn)行.用于DNA-A序列比較和進(jìn)化分析的病毒有越南番茄黃曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlVietnamvirus, TYLCVNV, EU189150)、越南番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlVietnamvirus, TLCVNV, GQ246941)、海南番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlHainanvirus, TLCHnV, FN256261)、豨薟黃脈病毒(SbYVV-Gz01, JX294076; SbYVV-GD27, AM230635; SbYVV-GD24, AM230634; SbYVV-GD13, AM183224; SbYVV-Fz11, JF682838)、廣西豨薟黃脈病毒(SbYVGxV-G111, AM238692)、中國(guó)番木瓜曲葉病毒(PaLCCNV-Fz10, JF682837; PaLCCNV-G12, AJ558116)、澤蘭黃脈病毒(Eupatoriumyellowveinvirus, EuYVV, AB433979)、雛菊黃花葉病毒(Erectitesyellowmosaicvirus, ErYMV, DQ641698)、勝紅薊黃脈病毒(Ageratumyellowveinvirus, AYVV, JN809815)、勝紅薊曲葉病毒(Ageratumleafcurlvirus, ALCV, AJ851005).用于betasatellite序列比較和進(jìn)化分析的病毒有廣西豨薟黃脈病毒衛(wèi)星(Siegesbeckia yellow vein Guangxi betasatellite, SbYVGxB-G111, AM238695)、豨薟黃脈病毒衛(wèi)星(Siegesbeckia yellow vein betasatellite, SbYVB-Fz11, JF682839; SbYVB-GD27, AM230645; SbYVB-GD24, AM230644; SbYVB-GD13, AM230643)、一點(diǎn)紅黃脈病毒衛(wèi)星(Emilia yellow vein betasatellite, EmYVB, FJ869906)、中國(guó)勝紅薊黃脈病毒衛(wèi)星(Ageratum yellow vein China betasatellite, AYVCNB, HF569262)、澤蘭黃脈病毒衛(wèi)星(Eupatorium yellow vein betasatellite, EuYVB, AB300464)、中國(guó)番木瓜曲葉病毒衛(wèi)星(Papaya leaf curl China betasatellite, PaLCCNB, DQ641709)、金銀花黃脈花葉病毒衛(wèi)星(Honeysuckle yellow vein mosaic betasatellite, HYVMB, JQ728545)、雛菊黃花葉病毒衛(wèi)星(Erectites yellow mosaic betasatellite, ErYMB, DQ641713).

2 結(jié)果與分析

2.1 Fz02 DNA-A基因組結(jié)構(gòu)特征

利用雙生病毒簡(jiǎn)并引物PA和PB，對(duì)3個(gè)表現(xiàn)黃脈癥狀的豨薟樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到1條約500 bp的特異性條帶.對(duì)該500 bp產(chǎn)物進(jìn)行載體克隆，隨機(jī)各挑取3個(gè)克隆送交公司測(cè)序.結(jié)果表明，序列之間相似性均在99%以上，此片段與一些雙生病毒的部分序列高度同源.選擇Fz02樣品進(jìn)行全長(zhǎng)序列擴(kuò)增.由此500 bp片段設(shè)計(jì)一對(duì)背向引物(Sig-Full-F和Sig-Full-R)，擴(kuò)增出1條約2.7 kb特異性條帶.全序列測(cè)定拼接后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)z02 DNA-A全長(zhǎng)2771 nts(GenBank登錄號(hào)為KF499589).Fz02 DNA-A基因組結(jié)構(gòu)具有典型的雙生病毒特性，共編碼7個(gè)ORFs：病毒鏈編碼2個(gè)ORFs(AV1和AV2)，互補(bǔ)鏈編碼5個(gè)ORFs(AC1、AC2、AC3、AC4和AC5)(圖2A).在這些編碼區(qū)之間的基因間隔區(qū)(intergenic region, IR)內(nèi)含有雙生病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必需的各種元件，包括一個(gè)含有9個(gè)核苷酸TAATATT/AC的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；TATA Box位于2670-2675 nts；重復(fù)序列GGTAC位于TATA Box 5′端的2618-2622、2626-2630和2661-2665 nts.

A.DNA-A基因組結(jié)構(gòu);B.Betasatellite基因組結(jié)構(gòu);C.DNA-A核苷酸變異分布;D.Betasatellite核苷酸變異分布.圖2 Fz02全基因組結(jié)構(gòu)及侵染豨薟的雙生病毒核苷酸變異分布Fig.2 Genomic organization of Fz02 and distribution of genetic variation estimated by nucleotide diversity (Pi)for Siegesbeckia-infecting geminiviruses

2.2 Fz02 DNA-A與其他雙生病毒的同源性比較

將Fz02 DNA-A全序列進(jìn)行NCBI BLAST檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)z02與廣東和福建報(bào)道的SbYVV同源性最高，其中與廣州分離物(Gz01)的同源性為93.4%，與福州分離物(Fz11)的同源性為91.3%；而與其余雙生病毒的同源性均在84.8%以下(表1).IR區(qū)是基因組中變異最大的區(qū)域，F(xiàn)z02的IR區(qū)有291 nts，與SbYVV-Gz01 IR相似性為86.5%，而與其他相關(guān)病毒的相似性均在79.3%以下(表1).氨基酸相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除了AV2與SbYVV-Fz11同源性最高(達(dá)96.6%)外，F(xiàn)z02編碼的ORFs與SbYVV-Gz01對(duì)應(yīng)ORF具有最高的序列相似性，其中AV1和AC3的同源性分別高達(dá)96.5%和96.3%，而AV2、AC1、AC2和AC4的同源性分別為91.5%、94.7%、92.6%和90.7%.值得注意的是，F(xiàn)z02編碼的AC4與SbYVV其他幾個(gè)分離物(Fz11、GD13、GD24、GD27)的同源性?xún)H為76.3%-78.4%(表1).此外，F(xiàn)z02還編碼一個(gè)AC5 ORF(圖2A)，這在與之同源關(guān)系較近的病毒中都未曾發(fā)現(xiàn).而利用Simplot軟件中的similarity plot和bootscanning對(duì)相關(guān)序列進(jìn)行重組性分析，未發(fā)現(xiàn)與其他病毒重組的信號(hào).

表1 Fz02與其他15種相關(guān)雙生病毒DNA-A、IR及各ORFs的同源性比較1)Table 1 Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of complete DNA-A, IR and ORFsbetween Fz02 DNA-A and other 15 geminiviruses %

1)a核苷酸序列同源性；b氨基酸序列同源性.

從圖3A可以看出，F(xiàn)z02與豨薟上分離到的其他病毒(SbYVV及SbYVGxV-G111)形成一個(gè)獨(dú)立分支，并且與SbYVV-Gz01同源關(guān)系較近.

系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)由MEGA 5.0的鄰近相連法構(gòu)建，步差值為1000.圖3 基于Fz02和其他相關(guān)雙生病毒(A)及伴隨的betasatellite分子(B)全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based upon alignments of the complete nucleotide sequences of the DNA-A components (A)and betasatellite molecules (B) with other related geminiviruses

2.3 病毒伴隨的betasatellite分子結(jié)構(gòu)及其同源性比較

利用設(shè)計(jì)的衛(wèi)星分子的特異性引物，在病毒分離物Fz02中擴(kuò)增到betasatellite分子(Fz02β).序列測(cè)定表明，F(xiàn)z02β全長(zhǎng)1359 nts(GenBank登錄號(hào)為KF499590)，互補(bǔ)鏈上編碼1個(gè)βC1 ORF，在1260-15 nts之間含1個(gè)長(zhǎng)為115 nts的衛(wèi)星保守區(qū)域(satellite conserved region, SCR)，SCR區(qū)含有雙生病毒科病毒共有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和TAATATT/AC(圖2B).Fz02β的全序列與SbYVV各分離物(GD13、GD24、GD27)的衛(wèi)星分子的同源性最高，分別為85.3%、85.1%和84.2%；與其他已報(bào)道的衛(wèi)星betasatellite的同源性均低于76.3%.值得注意的是，F(xiàn)z02β與Fz11β的同源性只有65.1%.另外，F(xiàn)z02β全序列中不含有beta01和beta02的引物序列，這也是用此引物未能擴(kuò)增到特異片段的原因.

從圖3B可以看出，F(xiàn)z02β與豨薟上分離到的其他病毒衛(wèi)星(SbYVB及SbYVGxB-G111)形成一個(gè)獨(dú)立分支，并且與SbYVB廣東分離物(GD13、GD24、GD27)同源關(guān)系較近.

2.4 Fz02基因組結(jié)構(gòu)變異分析

利用DnaSP軟件對(duì)7個(gè)相關(guān)病毒分離物及其6個(gè)病毒伴隨衛(wèi)星進(jìn)行了全基因組的序列變異分析，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)基因組上的變異不均勻(圖2C、D).其中，DNA-A中最大的變異峰值集中在AC4 ORF N端和AC1 ORF N端，另外2個(gè)小的變異峰值分布于AC5和AV1內(nèi)，其他區(qū)域較為保守.衛(wèi)星分子中變異峰值集中在βC1 ORF的下游區(qū)域，以及SCR和A-rich區(qū)之間的區(qū)域，而A-rich區(qū)和βC1 ORF相對(duì)保守.DNA-A與衛(wèi)星分子相比，后者具有更大的變異性.

3 討論

本研究表明，F(xiàn)z02與廣東報(bào)道的SbYVV-Gz01的同源性最高，達(dá)93.4%.根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)制定的雙生病毒種的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，全長(zhǎng)基因組(即DNA-A)核苷酸序列相似性小于89%，定為不同病毒種；大于89%即為同一病毒的不同分離物或株系[14].因此認(rèn)為Fz02是SbYVV的一個(gè)分離物.

本文從福州地區(qū)常見(jiàn)的雜草豨薟上分離到的SbYVV，與本實(shí)驗(yàn)室5年前從同一地點(diǎn)采集到的樣品[5]所鑒定的病毒同源關(guān)系僅為91.3%，且未發(fā)現(xiàn)PaLCCNV的復(fù)合侵染.系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)也表明，F(xiàn)z02與SbYVV廣州分離物親緣關(guān)系最近.對(duì)SbYVV各分離物進(jìn)行全基因組變異分析，表明DNA-A和betasatellite都具有不同程度的變異，且存在較高的變異峰值區(qū).研究表明，雙生病毒及其伴隨衛(wèi)星分子顯示共進(jìn)化的關(guān)系，并且根據(jù)其寄主及地理起源的不同而聚類(lèi)為不同的分支[15].因此有必要通過(guò)構(gòu)建SbYVV和PaLCCNV的侵染性克隆對(duì)兩者的寄主范圍及其進(jìn)化變異關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Molecular identification of the pathogen inducing Siegesbeckiayellow vein disease in Fuzhou

ZHANG Jie, LIN Wen-wu, ZHU Chong-qing, WU Jin-hong, CHEN Xiao-min, ZHANG Song-bai, WU Zu-jian

(Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province/Institute of Plant Virology, Fujian Agricultureand Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To determine the virus species infectingSiegesbeckiaorientalisin Fuzhou, Fujian Province, weed samples showing typical geminivirus-like symptoms were tested by PCR using virus-specific primers. A fragment of 500 bp was consistently amplified from total DNA extracts of 3 samples with universal primers PA/PB for geminivirus. Comparison of partial DNA sequences revealed that these samples were infected by a same virus and thus an isolate denoted Fz02 was selected for further sequence analysis. The complete sequence of Fz02 comprised 2771 nucleotides with typical genomic organization of begomoviral DNA-A. Fz02 was most closely related toSiegesbeckiayellowveinvirusisolate Gz01 (SbYVV-Gz01), with 93.4% nucleotide sequence identity. Specific primers were designed for the amplification of full length betasatellite genome which was then cloned and sequenced. The complete sequence of betasatellite (Fz02β) was determined to be 1359 nucleotides. Betasatellite shared the highest identity (85.3%) with isolate of SbYVV (GD13). Phylogenetic analysis showed that Fz02 clustered together with isolates of SbYVV. In addition, there were significant differences among sequences of SbYVV.

Geminivirus;Siegesbeckiayellowveinvirus;Siegesbeckiaorientalis; sequence variation

2014-03-13

2014-05-05

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B03)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(200903034)；福建農(nóng)林大學(xué)A類(lèi)畢業(yè)生科研啟動(dòng)基金(132130011).

張潔(1983-)，女，講師，博士.研究方向：植物病毒學(xué).Email:jiezhang3553@163.com.通訊作者吳祖建(1967-)，男，研究員，博士.研究方向：植物病毒學(xué).Email:wuzujian@126.com.

S432.1

A

1671-5470(2015)02-0126-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.003