稻瘟病菌MoYpt7互作蛋白的初步篩選

齊堯堯, 周 潔, 張冬梅, 張宏鑫, 李光普, 魯國東

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

稻瘟病菌MoYpt7互作蛋白的初步篩選

齊堯堯1, 周 潔2, 張冬梅1, 張宏鑫2, 李光普1, 魯國東1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以稻瘟病菌MoYpt7激活型為誘餌蛋白，從稻瘟病菌不同生長發(fā)育階段的cDNA文庫中篩選互作蛋白，經(jīng)復(fù)篩得到10個候選互作蛋白基因，利用BiFC或pull-down assay驗證蛋白間的互作，為尋找MoYpt7下游調(diào)控侵染致病過程的效應(yīng)因子提供依據(jù).

稻瘟病菌; 酵母雙雜交; 篩選; MoYpt7; 互作蛋白

稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)能引起世界性的重要病害稻瘟病，嚴重制約著世界各國的糧食安全[1,2],該真菌已成為研究病原真菌與植物互作、絲狀真菌生長發(fā)育和侵染致病機制的重要模式生物[3,4].研究表明，至少有2個信號途徑及大量的基因參與調(diào)控稻瘟病菌的侵染致病過程，一是依賴于cAMP的蛋白激酶途徑[5]，二是MAP蛋白激酶級聯(lián)機制[6]，近來發(fā)現(xiàn)囊泡運輸可能在稻瘟病菌的生長發(fā)育和致病過程中起重要作用.Fischer-Parton et al[7]首先觀察到了胞吞現(xiàn)象；Atkinson et al[8]研究表明，胞吞作用貫穿于分生孢子萌發(fā)至侵染水稻過程的早期階段，暗示著胞吞作用與稻瘟病菌的致病性存在相關(guān)性；Dou et al[9]研究表明，在稻瘟病菌中，SNARE蛋白MoVam7參與囊泡的融合和胞吞作用，是稻瘟病菌生長發(fā)育和致病所必需的，這預(yù)示著Rab GTPase家族蛋白介導(dǎo)的胞吞作用可能在稻瘟病菌的侵染致病過程起重要作用.

Rab GTPaes家族蛋白作為重要的分子開關(guān)，調(diào)控著胞吞作用和膜運輸過程中各個環(huán)節(jié)，這在動植物和微生物中已有廣泛的研究[10-12]，近年來在植物病原真菌中的作用也有報道.在植物病原菌菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)中Rab/GTPase CLPT1通過調(diào)控著胞內(nèi)分泌囊泡的運輸，將相關(guān)蛋白運送至胞外，并分化侵染結(jié)構(gòu)等一系列過程來調(diào)控該菌的致病性[13]，而在玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)中，t-SNARE蛋白YUP1與Rab5a共定位于早期內(nèi)涵體，在該菌致病的早期過程中發(fā)揮重要作用[14].但是迄今為止，稻瘟病菌中Rab家族蛋白的生物功能卻知之甚少.前期對稻瘟病菌中MoYpt7基因敲除表明，MoYpt7的缺失導(dǎo)致菌絲體細胞中泡囊變小并導(dǎo)致稻瘟病菌的致病性喪失(數(shù)據(jù)另發(fā)表)，說明MoYpt7對稻瘟病菌的致病性至關(guān)重要，并可能通過參與細胞內(nèi)泡囊膜融合和囊泡運輸起作用.

由于Rab蛋白主要是通過其上游的調(diào)節(jié)蛋白和下游的效應(yīng)蛋白執(zhí)行生物學(xué)[11]，近年來對Rab蛋白調(diào)控因子及效應(yīng)因子的研究日趨廣泛，對這些蛋白的研究可以深入了解特異泡囊運輸各個階段中Rab成員的重要功能.研究表明，Rab7/Ypt7通過與下游的效應(yīng)因子相互作用，調(diào)控著晚期內(nèi)涵體的生物合成、與溶酶體的膜運輸和融合、并影響著晚期內(nèi)涵體和循環(huán)受體的定位[15].目前發(fā)現(xiàn)Rab7的效應(yīng)蛋白RILP 和ORP1L調(diào)控晚期內(nèi)涵體的胞內(nèi)定位和脂質(zhì)運輸[16,17]，F(xiàn)YCO1調(diào)控細胞內(nèi)自噬體的重新分配[18]，Vps34協(xié)調(diào)早期內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體的膜組成[19]，XAPC7是內(nèi)涵體與白酶體降解之間的橋梁[20]，Rabring7與晚期內(nèi)涵體和溶酶體有關(guān)[21]，Retromer介導(dǎo)晚期內(nèi)涵體上貨物的回收[22]，酵母Ypt7效應(yīng)蛋白Mon1-Ccz1參與晚期內(nèi)涵體的成熟和多泡體的運輸[23]，而Vps41/HOPS則介導(dǎo)晚期內(nèi)涵體與溶酶體的融合[24].

為了探討MoYpt7調(diào)控稻瘟病菌生長發(fā)育及致病性的信號網(wǎng)絡(luò)，本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以激活型MoYpt7為誘餌蛋白，篩選稻瘟病菌復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)中與MoYpt7互作的蛋白，進一步篩選調(diào)控侵染致病的下游效應(yīng)因子，明確MoYpt7與其效應(yīng)因子在信號通路中的協(xié)同關(guān)系，為深入了解MoYpt7調(diào)控稻瘟病菌侵染致病的分子機制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 稻瘟病菌菌株Guy11由法國Didier Tharreau博士惠贈；大腸桿菌E.coliDH5α由實驗室保存.pGEM-T Easy載體購自Promega公司，釀酒酵母菌株AH109和Y187，酵母表達載體pGADT7-Rec和pGBKT7均購自Clontech公司；稻瘟病菌不同生長發(fā)育階段雙雜交cDNA文庫由本實驗室構(gòu)建并保存.

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)LB培養(yǎng)基(1L):10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，加蒸餾水溶解并定容至1 L，調(diào)至pH 7.0.

(2)SOB培養(yǎng)基(1L):5 g酵母提取物，0.5 g氯化鈉，20 g胰蛋白胨，2.5 mL 1 mol·L-1氯化鉀，pH 7.0，高壓滅菌后在每100 mL的小份中加1 mL 1 mol·L-1氯化鎂.

(3)YPDA培養(yǎng)基(100 mL):1 g酵母提取物，2 g胰蛋白棟，0.8 mL 100×Ade，20 μL 10 mol·L-1NaOH，90 mL雙蒸水，如配固體培養(yǎng)基則加入2 g瓊脂粉，高壓滅菌，待冷卻至50-55 ℃,加10 mL 20%無菌過濾器過濾除菌的葡萄糖溶液.

(4)SD/-Trp培養(yǎng)基(100 mL)：0.07 g四缺物10×Dropout-Trp/-Leu/-His/-Ade，0.7 g無氨基酵母氮源，雙蒸水95 mL，20 μL 10 mol·L-1NaOH，如配固體培養(yǎng)基則加人2 g瓊脂粉.高壓滅菌后加5 mL 40%葡糖糖，0.8 mL 100×Ade，0.2 mL 500×His和1 mL 100×Leu.

(5)其他缺陷型培養(yǎng)基基本成分同上，再加入所缺的氨基酸和葡萄糖.

1.1.3 試劑 PCR引物由上海英駿公司合成；3-AT購自Sigma公司；X-α-Gal購自Clontech公司；四缺物，無氨基酵母氮源和各種氨基酸購自天根；DNA測序由華大基因完成.

1.2 方法

1.2.1 酵母表達載體的構(gòu)建 以稻瘟病菌菌株Guy11全長單鏈cDNA為模板，分別利用MoYpt7閱讀框內(nèi)的2對引物P1F/P1R和P2F/P2R擴增出2段重疊的片段，然后通過over-lap PCR將2個片段連接起來，并引入突變位點.同時在引物P1F和P2R的5′端分別插入EcoRⅠ和SalⅠ限制性酶切位點，將其克隆到pGEM-T Easy載體上，經(jīng)測序確定位點突變正確后，再用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切，克隆到pGBKT7載體上，形成pGBKT7-MoYpt7-CA重組誘餌質(zhì)粒.

P1F:5′CGGAATTCATGTCGTCCAGAAAGAAGGTTC 3′

P1R:5′ACTGAAATCTCTCCAGACCAGCAGTATCCCA 3′

P2F:5′TGGGATACTGCTGGTCTGGAGAGATTTCAGT 3′

P2R:5′GCGTCGACTTAGGAGGCGGATCCATCCC 3′

1.2.2 激活型MoYpt7重組誘餌質(zhì)粒的毒性試驗和自激活試驗 將pGBKT7-MoYpt7-CA重組誘餌質(zhì)粒和pGBKT7空載體(陰性對照)分別轉(zhuǎn)入Y187菌株，提取酵母質(zhì)粒，經(jīng)PCR分子驗證后保存酵母克隆子.

將保存的酵母克隆子分別劃線接種到SD/-Trp培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察和比較兩組酵母菌的生長情況，驗證重組誘餌質(zhì)粒是否對酵母細胞有毒性作用.同時將酵母克隆子分別劃線接種于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade平板上，30 ℃培養(yǎng) 2-5 d，檢測報告基因MEL1、HIS3和ADE2的激活情況，驗證重組誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄自激活情況.

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化子的交配和篩選 如表1所示，實驗組分別將1 mL 25 ℃水浴融化的文庫AH109菌液與5 mL pGBKT7-MoYpt7-CA的Y187菌液緩慢加入到2 L的三角瓶中，再沿壁加入45 mL 2xYPDA液體培養(yǎng)基，輕輕混勻菌液于30 ℃，45 r·min-1交配24 h;然后將交配液經(jīng)離心重懸后定量到10 mL,按照每個平板250 uL的交配液均勻涂布于50個15 cm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3-7 d，挑取直徑大于2 mm的白色且中間呈突起狀的菌落，到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上繼續(xù)篩選，4-6 d后挑取顯藍色的克隆子作進一步的驗證.

表1 本研究所用的質(zhì)粒Table 1 The plasmids used in this study

陽性對照組將AH109[pGADT7-RecT]和Y187[pGBKT7-53]進行小量交配，在SD/-Trp/-Leu/平板上篩選克隆子，并在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上進行表型驗證，其中已知T蛋白和53蛋白2種蛋白可以相互作用.

陰性對照組將AH109[pGADT7-RecT]和Y187[pGBKT7-Lam]進行小量交配，在SD/-Trp/-Leu/平板上篩選克隆子，并在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上進行表型驗證，其中已知T蛋白和Lam蛋白不能相互作用.

1.2.4 互作陽性克隆子的驗證及測序 挑取假定的互作克隆子重新涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+10mM 3-AT(3-AT可以降低由于HIS3的泄漏表達造成的高背景)平板上進行重復(fù)驗證；然后將克隆子涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal進行顯色驗證.將經(jīng)過多次重復(fù)驗證過的陽性克隆子搖菌，提取酵母質(zhì)粒.以酵母質(zhì)粒為模板，用pGADT7-Rec載體的通用引物P3F(5′CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC 3′)和P3R(5′GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT 3′)對其進行PCR擴增，檢測cDNA片段的大小.選取PCR產(chǎn)物不小于200 bp的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)中，提取細菌質(zhì)粒，用pGADT7-Rec載體通用引物P3F和P3R進行PCR擴增，驗證cDNA片段是否與從酵母質(zhì)粒中擴增的片段大小一致.選取大小一致的陽性克隆保存菌液并進行cDNA測序，將測序結(jié)果與M.oryzae數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得同源序列及注釋信息，進而分析陽性克隆中插入cDNA的信息.

2 結(jié)果與分析

2.1 MoYpt7激活型突變體及酵母表達載體的構(gòu)建

以釀酒酵母中的Ypt7的蛋白序列為靶序列，在Magnaportheoryzae數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對，得到MGG_08144基因，并將其命名為MoYpt7.研究表明，Rab蛋白只有在GTP結(jié)合形式下才能特異性的結(jié)合效應(yīng)因子并發(fā)生相互作用[11]，為了獲得更多與 MoYpt7互作的效應(yīng)蛋白，明確其介導(dǎo)的信號網(wǎng)絡(luò)，本研究采用激活型的MoYpt7作為誘餌篩選互作蛋白，即在引物序列中將MoYpt7第67位谷氨酰胺Q(CAG)突變成亮氨酸L(CTG)，使其一直保持GTP的狀態(tài)，得到激活型突變體MoYpt7-CA(Q67L).同時，Rab蛋白的C末端翻譯后會進行異戊二烯化的修飾，該修飾與其質(zhì)膜定位有關(guān)[10]，而根據(jù)酵母雙雜交技術(shù)原理，融合蛋白必須進入核內(nèi)才能轉(zhuǎn)錄，因此本研究還在引物序列中將第203位和205位表達的半胱氨酸C(TGC)突變成絲氨酸S(TCC)，通過over-lap PCR得到MoYpt7-CA(Q76L;C203S，C205S)片段.經(jīng)測序正確后將MoYpt7-CA(Q76L;C203S，C205S)片段克隆到pGBKT7的EcoRⅠ/SalⅠ酶切位點上，得到pGBKT7-MoYpt7-CA重組質(zhì)粒.對該重組質(zhì)粒進行酶切驗證，發(fā)現(xiàn)目的條帶(618 bp)在500和750 bp之間(圖1).測序結(jié)果再次驗證誘餌載體構(gòu)建成功.

2.2 pGBKT7-MoYpt7-CA重組質(zhì)粒毒性及其自激活檢測

將pGBKT7-MoYpt7-CA重組質(zhì)粒和pGBKT7空載體分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，由于pGBKT7上帶有Trp選擇標記，因此轉(zhuǎn)化了這兩組質(zhì)粒的酵母菌株Y187都能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長.分別挑取若干SD/-Trp培養(yǎng)基上的單克隆菌落提取酵母質(zhì)粒，用MoYpt7特異引物P1F和P2R鑒定陽性克隆.由于酵母中沒有MoYpt7基因，因此擴增的條帶反映了酵母細胞中已含有的MoYpt7-CA重組質(zhì)粒.結(jié)果表明，挑取的3個pGBKT7-MoYpt7-CA轉(zhuǎn)化酵母的克隆子均可以擴增到618 bp的片段(MoYpt7閱讀框的大小)(圖2)，挑選Y187菌液保存并做進一步的分析，而pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化酵母后所得到的克隆子經(jīng)PCR驗證無條帶(圖2).

M.DNA Marker 5000;1.誘餌蛋白質(zhì)粒.圖1 誘餌蛋白的酶切驗證Fig.1 Digestion of bait protein M.Marker 2000 DNA Ladder；P.陽性對照；N.陰性對照； 1-3.重組質(zhì)?？寺∽?；4.pGBKT7克隆子.圖2 PCR驗證酵母轉(zhuǎn)化子Fig.2 PCR examination of yeast transformants

將重組誘餌質(zhì)?？寺∽优c對照組的pGBKT7克隆子分別劃線于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，3A)，另外兩者的菌液濃度無明顯的差別，說明重組誘餌質(zhì)粒的表達產(chǎn)物對酵母細胞無毒性作用.

檢測pGBKT7-MoYpt7-CA重組質(zhì)粒的自激活活性，如圖3中B-D所示，含有pGBKT7-MoYpt7-CA重組質(zhì)粒的酵母菌Y187可以在 SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長且不顯藍色(圖3B)，同時無法在SD/-His/-Trp/X-α-Gal(圖3C)和SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal(圖3D)培養(yǎng)基上生長,而陽性對照在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-His/-Trp/X-α-Gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal (圖3B-D) 培養(yǎng)基上均能生長且菌落顯藍色，以上結(jié)果表明酵母Y187內(nèi)的pGBKT7-MoYpt7-CA重組質(zhì)粒無法激活轉(zhuǎn)錄報告基因ADE2、HIS3和MEL1的表達，即不具有自激活活性，可用于后續(xù)互作蛋白的篩選.

A.誘餌蛋白的毒性檢測；B-D.誘餌蛋白的自激活檢測；B.SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基；C.SD/-His/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基； D.SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基；a.陽性對照；b.含有誘餌蛋白的Y187；c.含有空載體的Y187.圖3 誘餌蛋白毒性和自激活檢測Fig.3 Test of bait protein in toxicity and autoactivation

2.3 酵母交配及MoYpt7互作蛋白陽性克隆的篩選

將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-MoYpt7-CA的Y187酵母菌株與含有稻瘟病菌不同生長發(fā)育階段(孢子、菌絲、芽管、附著胞)cDNA文庫的酵母菌株AH109進行交配，24 h后發(fā)現(xiàn)視野中約70%的細胞融合并出現(xiàn)接合子，停止交配.直接將交配液涂布于50個15 cm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上，進行初步篩選，挑取菌落生長良好、直徑大于2 mm的克隆子于新的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板(圖4A)上進行篩選，一共得到了約4000個酵母克隆子.其中，陽性對照和陰性對照按照表1進行小量轉(zhuǎn)化，與實驗組同時進行.然后通過顯色實驗排除假陽性，發(fā)現(xiàn)大部分的克隆子可顯藍色，說明互作的克隆子可以激活報告基因 MEL1的表達.排除那些不顯藍色的克隆子，將顯藍色的克隆子重新接種至新鮮的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上進行重復(fù)驗證，其顯色情況如圖4B所示，共得到582個互作克隆子.

A.SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基;B.SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基；P.陽性對照；N.陰性對照.圖4 部分陽性克隆的篩選Fig.4 Partially screened positive colonies

2.4 陽性克隆子的測序及分析

將經(jīng)過顯色驗證的582個互作克隆子分別搖菌，提取酵母質(zhì)粒，以酵母質(zhì)粒為模板，用pGADT7-Rec載體的通用引物進行PCR擴增，檢測插入cDNA片段大小，獲得300-2000 bp的片段約229個，部分結(jié)果見圖5.將229個酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的超感細胞中，提取細菌質(zhì)粒，再次用pGADT7-Rec載體通用引物進行PCR擴增，比較前后2次PCR擴增的插入片段是否相同，共得到了85個結(jié)果一致的cDNA插入序列.去除大小相同的重復(fù)插入，將候選的35個cDNA插入進行測序，測序結(jié)果與稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫進行比對，除去移碼突變和重復(fù)的蛋白，共獲得10個候選的互作蛋白基因(表2)，其中有2個基因(MGG_016187和MGG_16251)無基因注釋，1個編碼預(yù)測蛋白(MGG_09718)，一個編碼保守的假定蛋白(MGG_01127)，剩余6個基因分別編碼泛素連接酶、轉(zhuǎn)錄起始因子亞基5、α葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、60S核糖體蛋白L31和ATP NAD激酶.

M.DNA MarkerⅢ；1-17.克隆子.圖5 PCR驗證部分MoYpt7互作克隆子cDNA插入片段的大小Fig.5 PCR identification of some cDNA insert fragments of MoYpt7 interacting clones表2 陽性克隆子的測序及結(jié)果比對Table 2 Sequencing results and analysis of positive clones

插入片段長度/bp基因號基因注釋ORF完整性編碼一致性459MGG＿16187Nogeneannotation不完整一致259MGG＿06562Ubiquitin-conjugatingenzyme不完整一致379MGG＿09718Predictedprotein不完整一致286MGG＿06742TranscriptioninitiationfactorTFIIDsubunit5不完整一致255MGG＿01127Conservedhypotheticalprotein不完整一致367MGG＿01084Glyceraldehyde?3?phosphatedehydrogenase不完整一致34MGG＿12988Alpha?glucosidetransportprotein不完整一致28MGG＿16251Nogeneannotation不完整一致208MGG＿0372760SribosomalproteinL31不完整一致176MGG＿08159ATPNADkinase不完整一致

3 討論與結(jié)論

酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system, Y2H)現(xiàn)已發(fā)展為鑒定和檢測蛋白質(zhì)相互作用的重要方法[25,26].本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)對稻瘟病菌中MoYpt7的互作蛋白進行篩選，因受新建cDNA文庫質(zhì)量和酵母雙雜交體系步驟多、時間長等影響，經(jīng)反復(fù)驗證最終得到10個候選的互作蛋白基因，將這些序列在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome.html)中進行比對，得到相關(guān)基因的注釋(表2).

其中，MGG_06562編碼泛素連接酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)，是E2s家族的成員，含有高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBC)，該結(jié)構(gòu)域由4個ɑ-螺旋，1個較短的螺旋，和4條肽鏈組成的反平行β-折疊構(gòu)成.研究表明，E2s的主要作用是特異選擇靶蛋白上的Lys位點與泛素分子共價結(jié)合，并且決定了泛素鏈的特異性連接方式及長度，從而影響靶蛋白的命運[27]；蛋白經(jīng)在核糖體合成，經(jīng)泛素化修飾之后會通過囊泡運輸?shù)侥康牡兀瓿墒姑髸贿\輸?shù)酵砥趦?nèi)涵體或者溶酶體進行降解，而此過程需要MoYpt7蛋白的參與.

MGG_06742編碼轉(zhuǎn)錄起始因子亞基5(TFIID)，含有LisH, WD40 associated region in TFIID subunit, WD結(jié)構(gòu)域,G-beta repeat結(jié)構(gòu)域.TFIID作為轉(zhuǎn)錄激活輔助因子與轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用，并識別表觀遺傳標記，引發(fā)起始復(fù)合物前體形成[28].蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄離不開轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而囊泡運輸則可能貫穿其中，因此MoYpt7可能與其發(fā)揮協(xié)同作用，存在一定的互作關(guān)系.

MGG_01084編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)， 含有N端所特有的NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端的Gp_dh_C結(jié)構(gòu)域.由于GAPDH在大部分組織和細胞中均穩(wěn)定存在且高表達，因此它也被當(dāng)做一種管家基因，運用于分子實驗中作為內(nèi)參.芽殖酵母的TDH1蛋白是MGG_01084的同源蛋白，在細胞的糖酵解和糖異生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，因其亞細胞定位的不同還發(fā)揮多種多樣的功能[29].此外，GAPDH還調(diào)控著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的泡囊運輸，其在Rab2的協(xié)助下定位到泡囊管狀聚合體促進COP1泡囊的形成[30].而GAPDH與MoYpt7的互作關(guān)系仍需要進一步確定.

MGG_12988編碼α葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，與釀酒酵母中的MAL61同源，編碼麥芽糖通透酶，其轉(zhuǎn)錄需要麥芽糖的誘導(dǎo)并需要抑制葡萄糖的含量，其二級結(jié)構(gòu)中包含2個開關(guān)，控制著6個跨膜結(jié)構(gòu)域[31]，揭示了其作為跨膜蛋白具有共同結(jié)構(gòu)域，預(yù)示著在囊泡運輸和膜融合過程中與MoYpt7可能存在著聯(lián)系.

MGG_03727編碼60S核糖體蛋白L31(Rpl31),是Ribosomal_L31e亞家族的成員，含有23S rRNA結(jié)合位點.在釀酒酵母中，MGG_03727的同源蛋白是Rpl31，由Rpl31A和Rpl31B基因編碼.Rpl31和Rpl39獨立影響核糖體的功能，Rpl31與RAC功能上相互依賴，盡管RAC不需要Rpl31也可以結(jié)合到核糖體上，但是該分子伴侶復(fù)合體發(fā)揮了正確的功能[32].

MGG_08159編碼ATP NAD激酶, 含有特異的nadF，屬于DAGK_cat亞家族.ATP NAD激酶能利用ATP作為磷酰基供體，催化NAD發(fā)生磷酸化，生成NADP.NAD作為機體細胞內(nèi)最普遍的生物學(xué)反應(yīng)介質(zhì)，參與了多種多樣的生物進程，如能量代謝、還原性生物合成反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)等[33].另外有2個基因(MGG_16187和MGG_16251)在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫中沒有基因注釋；MGG_09718編碼的蛋白為預(yù)測蛋白，無任何保守的結(jié)構(gòu)域；MGG_01127編碼1個保守的假定蛋白，含有鋅指結(jié)構(gòu)域，能與DNA或RNA結(jié)合，是與基因表達調(diào)控有關(guān)的功能蛋白.

總之，從稻瘟病菌不同生長發(fā)育階段的cDNA文庫中篩選到的候選互作蛋白在其他生物中參與調(diào)控多種多樣的細胞進程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白的修飾和運輸、糖代謝、囊泡的運輸、分子伴侶和能量代謝等過程，推測這些互作蛋白在稻瘟病菌中可能起著類似的作用，預(yù)示著MoYpt7及其互作蛋白可能形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng).由于外源蛋白在酵母中表達時可能會發(fā)生錯誤折疊或修飾，因此利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白互作時不排除假陽性現(xiàn)象的存在，這些蛋白仍需要進一步通過BiFC 或pull-down技術(shù)驗證其與MoYpt7的相互作用，并明確互作機制，同時通過一系列遺傳和生化等分析手段明確這些互作蛋白在稻瘟病菌中的功能，這對于明確MoYpt7介導(dǎo)的囊泡運輸相關(guān)過程是如何有效地調(diào)控稻瘟病菌的致病機制是非常必要的.

[1] FISHER M C, HENK D A, BRIGGS C J, et al. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health[J]. Nature, 2012,484(7396):186-194.

[2] WILSON R A, TALBOT N J. Under pressure: investigating the biology of plant infection byMagnaportheoryzae[J]. Nature Reviews Microbiology, 2009,7(3):185-195.

[3] VALENT B, CHUMLEY F G. Molecular genetic analysis of the rice blast fungus,Magnaporthegrisea[J]. Annual Review of Phytopathology, 1991,29:443-467.

[4] TALBOT N J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology ofMagnaporthegrisea[J]. Annual Review of Microbiology, 2003,57:177-202.

[5] MITCHELL T K, DEAN R A. The cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit is required for appressorium formation and pathogenesis by the rice blast pathogenMagnaporthegrisea[J]. The Plant Cell, 1995,7(11):1869-1878.

[6] XU J R, STAIGER C J, HAMER J E. Inactivation of the mitogen-activated protein kinase Mps1 from the rice blast fungus prevents penetration of host cells but allows activation of plant defense responses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1998,95(21):12713-12718.

[7] FISCHER-PARTON S, Parton R M, HICKEY P C, et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae[J]. Journal of Microscopy, 2000,198(Pt 3):246-259.

[8] ATKINSON H A, DANIELS A, READ N D. Live-cell imaging of endocytosis during conidial germination in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J]. Fungal Genetics and Biology: FG & B, 2002,37(3):233-244.

[9] DOU X, WANG Q, QI Z, et al. MoVam7, a conserved SNARE involved in vacuole assembly, is required for growth, endocytosis, ROS accumulation, and pathogenesis ofMagnaportheoryzae[J]. PloS One, 2011,6(1):e16439.

[10] STENMARK H, OLKKONEN V M. The Rab GTPase family[J]. Genome Biology, 2001,2(5):REVIEWS 3007.

[11] ZERIAL M, MCBRIDE H. Rab proteins as membrane organizers[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001,2(2):107-117.

[12] STENMARK H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009,10(8):513-525.

[13] SIRIPUTTHAIWAN P, JAUNEAU A, HERBERT C, et al. Functional analysis of CLPT1, a Rab/GTPase required for protein secretion and pathogenesis in the plant fungal pathogenColletotrichumlindemuthianum[J]. Journal of Cell Science, 2005,118(Pt2):323-329.

[14] FUCHS U, HAUSE G, SCHUCHARDT I, et al. Endocytosis is essential for pathogenic development in the corn smut fungusUstilagomaydis[J]. The Plant Cell, 2006,18(8):2066-2081.

[15] WANG T, MING Z, XIAOCHUN W, et al. Rab7: role of its protein interaction cascades in endo-lysosomal traffic[J]. Cellular Signalling, 2011,23(3):516-521.

[16] CANTALUPO G, ALIFANO P, ROBERTI V, et al. Rab-interacting lysosomal protein (RILP): the Rab7 effector required for transport to lysosomes[J]. EMBO Journal, 2001,20(4):683-693.

[17] JOHANSSON M, LEHTO M, TANHUANPAA K, et al. The oxysterol-binding protein homologue ORP1L interacts with Rab7 and alters functional properties of late endocytic compartments[J]. Molecular Biology of the Cell, 2005:16(12):5480-5492.

[18] PANKIV S, ALEMU E A, BRECH A, et al. FYCO1 is a Rab7 effector that binds to LC3 and PI3P to mediate microtubule plus end-directed vesicle transport[J]. Jouranl of Cell Biology, 2010:188(2):253-269.

[19] STEIN M P, FENG Y, COOPER K L, et al. Human VPS34 and p150 are Rab7 interacting partners[J]. Traffic, 2003,4(11):754-771.

[20] DONG J, CHEN W, WELFORD A, et al. The proteasome alpha-subunit XAPC7 interacts specifically with Rab7 and late endosomes[J]. Journal of Biology Chemistry, 2004,279(20):21334-21342.

[21] MIZUNO K, KITAMURA A, SASAKI T. Rabring7, a novel Rab7 target protein with a RING finger motif[J]. Molecular Biology of the Cell, 2003,14(9):3741-3452.

[22] BURDA P, PADILLA S M, SARKAR S, et al. Retromer function in endosome-to-Golgi retrograde transport is regulated by the yeast Vps34 PtdIns 3-kinase[J]. Journal of Cell Science, 2002,115(Pt20):3889-3900.

[23] WANG C W, STROMHAUG P E, SHIMA J, et al. The Ccz1-Mon1 protein complex is required for the late step of multiple vacuole delivery pathways[J]. Journal of Biology Chemistry, 2002,277(49):47917-47927.

[24] CABRERA M, OSTROWICZ C W, MARI M, et al. Vps41 phosphorylation and the Rab Ypt7 control the targeting of the HOPS complex to endosome-vacuole fusion sites[J]. Molecular Biology of the Cell, 2009,20(7):1937-1948.

[25] 李向陽,張嘉保,任文郅,等.酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2011,26(1):26-28.

[26] 吳志豪,王建,賀福初.大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)作用的應(yīng)用[J].遺傳,2006,28(12):1627-1632.

[27] 陳建明.泛素綴合酶樣蛋白的研究概況[J].國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊,1999,21(6):333-337.

[28] BHATTACHARYA S, TAKADA S, JACOBSON R H. Structural analysis and dimerization potential of the human TAF5 subunit of TFIID[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007,104(4):1189-1194.

[29] DELGADO M L, O′CONNOR J E, AZORIN I, et al. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase polypeptides encoded by theSaccharomycescerevisiaeTDH1, TDH2 and TDH3 genes are also cell wall proteins[J]. Microbiology, 2001,147(2):411-417.

[30] TISDALE E J, ARTALEJO C R. A GAPDH mutant defective in Src-dependent tyrosine phosphorylation impedes Rab2-mediated events[J]. Traffic, 2007,8(6):733-741.

[31] NEEDLEMAN R B, KABACK D B, DUBIN R A, et al. MAL6 of Saccharomyces: a complex genetic locus containing three genes required for maltose fermentation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1984,81(9):2811-2815.

[32] PEISKER K, BRAUN D, WOLFLE T, et al. Ribosome-associated complex binds to ribosomes in close proximity of Rpl31 at the exit of the polypeptide tunnel in yeast[J]. Molecular Biology of the Cell, 2008,19(12):5279-5288.

[33] BERGER F, RAMIREZ-HERNANDEZ M H, ZIEGLER M. The new life of a centenarian: signalling functions of NAD(P)[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2004,29(3):111-118.

(責(zé)任編輯:吳顯達)

Primary screening of the interaction proteins of MoYpt7 fromMagnaportheoryzae

QI Yao-yao1, ZHOU Jie2, ZHANG Dong-mei1, ZHANG Hong-xin2, LI Guang-pu1, LU Guo-dong1

(1.College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University; 2.College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Interaction proteins were screened through the yeast two-hybrid system from the cDNA library of different developmental stages ofM.oryzaeby using the constitutively active version of MoYpt7 as bait protein, and 10 potential interaction proteins genes have been obtained by repeated screening. BiFC or pull-down assay was used to verify the interaction between proteins, so as to offer the evidence for searching the downstream effectors controlling the pathogenicity ofM.oryzae.

Magnaportheoryzae; yeast two-hybrid; screening; MoYpt7; interaction proteins

2014-12-26

2015-01-15

國家自然科學(xué)基金項目(31070124)；福建省教育廳重點項目(JA10098).

齊堯堯(1987-),女,博士研究生.研究方向:分子植物病理學(xué)與植病生理學(xué).Email:wenxuerubing@126.com.通訊作者魯國東(1967-),男,教授,博士生導(dǎo)師.研究方向：分子植物病理學(xué).Email:gdlufafu@163.com.

Q74

A

1671-5470(2015)02-0113-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.001