艾拉莫德對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞體外干預(yù)實驗研究*

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 (蘭州 730030)

王曉元 沈海麗▲

艾拉莫德對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞體外干預(yù)實驗研究*

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 (蘭州 730030)

王曉元 沈海麗▲

目的：觀察艾拉莫德(T-614)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜細(xì)胞(FLS)體外培養(yǎng)時，增殖生長能力的影響，探討艾拉莫德的對RA的治療機(jī)制。方法：采用噻唑藍(lán)(MTT)法和流式細(xì)胞儀觀察抗風(fēng)濕藥物艾拉莫德T-614對RA-FLS增殖變化，T-614分為高劑量組(1000μg/ml)、中劑量組(250μg/ml)和低劑量組(5μg/ml)，干預(yù)期間通過TNF-α(10ng/ml)刺激FLS并共孵育48h，并收上清液檢測IL-8水平表達(dá)。結(jié)果：高濃度組T-614較低濃度組及正常對照組對RA的FLS體外增殖具有明顯的抑制作用，檢測上清IL-8明顯減低。結(jié)論：T-614對TNF-α刺激下的RA-FLS有抑制增殖的作用，且趨化因子IL-8分泌水平減低，提示T-614對RA滑膜炎具有的免疫抑制調(diào)控作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎( Rheumatoid arthritis, RA) 是一種以滑膜炎為病理基礎(chǔ)的慢性多關(guān)節(jié)炎性的自身免疫疾病，患者關(guān)節(jié)滑膜炎嚴(yán)重程度與RA病情活動和預(yù)后密切相關(guān)，滑膜炎的病理表現(xiàn)為：血管翳生成、炎性因子分泌及骨和軟骨的破壞。艾拉莫德(Iguratimod)是一具有新的抗炎和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的小分子，成分為兩酰胺基、甲?；图谆交前饭倌軋F(tuán)的對氧奈酮衍生物[1]。本項研究觀察T-614對活動期RA患者的滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的干預(yù)，探討T-614抑制滑膜細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞因子等作用，了解T-614對RA治療的免疫學(xué)基礎(chǔ)，為RA患者臨床用藥，得到及時、準(zhǔn)確治療，改善預(yù)后提供依據(jù)。

對象與方法

1 研究對象 選取2013年10月至2014年2月在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院就診RA患者，行關(guān)節(jié)鏡滑膜清理術(shù)5例，男性1例，女性4例，年齡42～68歲，平均年齡55.9歲，均符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)修訂的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 滑膜組織的分離培養(yǎng)方法： 無菌條件下，將滑膜組織剪碎至1mm3小塊，通過加入膠原酶(Sigma公司)37°C消化1h，離心棄去上清，再使用胰蛋白酶消化30min，過200目細(xì)胞濾網(wǎng),沖洗離心棄上清。用10%FBS-DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2中培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，棄去未粘附細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)瓶貼壁傳代細(xì)胞，每3～5d換液，用0.25%胰蛋白酶EDTA消化并傳代，臺盼蘭染色檢測細(xì)胞活動大于90%以上。

2.2 RA的FLS觀察：4～6代滑膜細(xì)胞與不同劑量的T-614共撫育48h，進(jìn)行的蘇木素-伊紅染色(HE)染色，觀察滑膜細(xì)胞形態(tài)。

2.3 艾拉莫德(T-614)(先聲藥業(yè)公司惠贈)每片25mg，粉碎后震蕩20min后，溶解在2ml的DMSO中，過40μm篩網(wǎng)，配置成10mg/ml，分裝EP管中，細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)DMEM液稀釋10倍使用微孔過濾器過濾分裝使用。

2.4 噻唑藍(lán)(MMT)法細(xì)胞增殖檢測：培養(yǎng)4-6代的RA滑膜細(xì)胞計數(shù)后，加入96孔板培養(yǎng)撫育24h，加入T-614濃度為：1000、250、5μg/ml，同時，加入刺激物TNF-α每孔10ng/ml(TNF-α購自Sigma分裝)，設(shè)立空白和對照采用5%DMSO，共同孵育48h，MTT法測定各孔OD值，每組8個副孔，計算細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(Survival fraction，SF)。

2.5 細(xì)胞因子檢測: 收集相應(yīng)處理的滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-8含量，具體操作按相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，兩樣本數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RA滑膜細(xì)胞染色觀察：采用第4～6代滑膜細(xì)胞，具有生長突，呈梭型或者多形性，可見分裂相，核仁明顯。T-614干預(yù)后滑膜成纖維細(xì)胞增殖速度明顯減慢，細(xì)胞碎片和細(xì)胞核固縮，大小不等(附圖)。

A:空白組滑膜細(xì)胞呈多形性，細(xì)胞核邊界、核仁清楚，突觸較長，生長旺盛；B：250 μg/mlT-614共培養(yǎng)48h后，滑膜細(xì)胞整體數(shù)量減少，少見滑膜細(xì)胞破損，細(xì)胞核明顯縮小，邊界不清楚，破損表現(xiàn)，核仁不清楚

附圖 FLS的蘇木素-伊紅染色(×200倍)

2 T-614對RA滑膜細(xì)胞增殖的影響:T-614不同給藥組濃度加入RA滑膜細(xì)胞培養(yǎng)后，入各組SF值下降，不同給藥濃度組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異。對照組與加T-614藥物組均值比較有統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

表1 T-614對TNF-α誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞 SF的檢測

與對照組比較，*P<0.05

3 上清IL-8水平：RA滑膜細(xì)胞加入T-614，不同給藥組濃度，不同給藥濃度比RA滑膜細(xì)胞培養(yǎng)48h上清，檢測IL-8水平結(jié)果，對照組與加T-614藥物組均值比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 T-614對TNF-α誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-8的檢測

與對照比較，*P<0.05

討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜炎為病理基礎(chǔ)的自身免疫性疾病，發(fā)病2年即可出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。關(guān)節(jié)滑膜的過度增殖是RA關(guān)節(jié)炎，RA病理表現(xiàn)為滑膜組織充血，細(xì)胞異常增生，形成滑膜絨毛，最終形成血管翳，侵入骨和軟骨下的骨質(zhì)，是造成骨質(zhì)破壞的主要原因，通過探討藥物的免疫調(diào)控作用，觀察抑制滑膜增殖是基礎(chǔ)研究的重點，也是臨床用藥治療的基礎(chǔ)。T-614是一種小分子免疫制劑，在臨床實驗中，對減輕疾病活動，改善病情獲得了很好的治療作用。

本研究觀察RA滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)，應(yīng)用T-614藥物干預(yù)實驗，使用滑膜細(xì)胞的炎癥刺激因子TNF-α的作用下，觀察其增殖特點，同時檢測細(xì)胞因子IL-8分泌表達(dá)水平。之前文獻(xiàn)報道提示，在無介質(zhì)激活時，骨關(guān)節(jié)炎的成纖維滑膜細(xì)胞在體外出現(xiàn)增殖潛能，高劑量艾拉莫德對骨關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞分化及表達(dá)有直接抑制作用。并有報道在體外實驗中，使用T-614干預(yù)滑膜成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T-614通過抑制RA-FLS的c-fos mRNA表達(dá)，具有降低FLS增殖能力作用[2，3]。本文得到結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，但本實驗通過TNF-α炎癥刺激因子干預(yù)滑膜細(xì)胞，TNF-α是RA關(guān)節(jié)炎中最重要的致病因子，不僅具有刺激滑膜細(xì)胞增生，啟動MAPKs3個亞家族成員活化，導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，造成Th1/Th2失衡，最終關(guān)節(jié)炎癥加重，與RA發(fā)表及病程密切相關(guān)[4]。通過TNF-α刺激干預(yù)培養(yǎng)RA成纖維滑膜細(xì)胞后，我們觀察到T-614對FLS具有更為明確的抑制增殖作用，并隨劑量增加而抑制作用增強(qiáng)。故應(yīng)用T-614具有明顯抑制滑膜增殖的作用，提示在臨床應(yīng)用中，T-614具有改善關(guān)節(jié)炎癥、緩解病情的作用。

趨化性細(xì)胞因子(Chemokines ,CK)是一組由細(xì)胞核炎性細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)效益功能的小分子生物活性家族，白細(xì)胞介素-8(IL-8)基因于1988年克隆，IL-8是與炎癥極為密切的細(xì)胞因子，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，在外源性或內(nèi)源性因子：如脂多糖，TNF-α等誘導(dǎo)下可生產(chǎn)大量IL-8以及多種免疫炎癥因子，如NO、PGE-2、IL-1、IL-6等，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，激活粒細(xì)胞發(fā)生變形、游走、趨化和聚集，在炎癥部位產(chǎn)生侵潤作用[5]。文獻(xiàn)提示使用不同濃度IL-8作用常規(guī)培養(yǎng)條件下的RA成纖維滑膜細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)有直接促進(jìn)其增殖作用，并與濃度呈劑量依賴性。本研究得出，隨著T-614劑量增加，滑膜細(xì)胞上清的IL-8水平逐步下降，提示了T-614治療滑膜炎的新靶點，為抑制滑膜細(xì)胞生產(chǎn)IL-8，從而減少了關(guān)節(jié)炎癥的致病因素，同時減少滑膜細(xì)胞的增殖，在急性關(guān)節(jié)炎治療中T-614具有積極治療作用。

上述研究顯示，RA滑膜細(xì)胞在T-614干預(yù)條件下，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖水平減低， IL-8檢測水平下降。提示T-614治療RA的靶點作用可能抑制滑膜細(xì)胞增殖，同時減少IL-8關(guān)節(jié)炎致炎病因的免疫機(jī)制。

[1] 劉 丹,陳 妤,丁漢飛，等. 艾拉莫德(T-614)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)實驗與臨床療效的研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志,2013,22(9):1052-1055.

[2] 舒 強(qiáng),李興福,侯懷水，等. 艾拉莫德對骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞特性的影響[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2006,10(7):389-392，449.

[3] 舒 強(qiáng),李興福,劉花香，等. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞增殖特性的體外研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,11:1095-1099.

[4] 劉青松，蔣 紅，唐 中.丹參對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞腫瘤壞死因子α表達(dá)的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2009，8(3):74-76.

[5] Juarranz M, Mihara M. The roles of interleukin-6 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Rheumatol(Oxford),2004,43(4):416-422.

(收稿：2014-09-09)

*甘肅省科技廳基金項目(144FKCA060)

蘭州市科學(xué)技術(shù)局基金項目(2013-3-26)

@艾拉莫德 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕/免疫學(xué) 滑膜 細(xì)胞增殖 白細(xì)胞介素-8/分析 體外發(fā)生

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.011

▲通訊作者