慢性丙型肝炎病毒感染患者血清IL-35表達水平及其意義

西安市第八醫(yī)院肝病二科(西安710061)

尹 毅 賈元紅△ 姚向波▲

慢性丙型肝炎病毒感染患者血清IL-35表達水平及其意義

西安市第八醫(yī)院肝病二科(西安710061)

尹 毅 賈元紅△姚向波▲

目的： 通過檢測慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染者血清中白細胞介素-35(IL-35)的表達水平，探討IL-35在HCV持續(xù)感染致病機制中的作用。方法： 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 法檢測263例慢性丙型肝炎患者和117例健康體檢者的血清IL-35水平，并對不同臨床診斷的HCV患者間的IL-35水平進行比較分析，同時分析IL-35與ALT、AST、TBIL、ALB和HCVRNA的相關(guān)性。結(jié)果： HCV感染者血清IL-35水平明顯增高，高于健康對照者，其中HCV相關(guān)的肝癌IL-35水平最高3926.1(297.2～4129.1) pg/ml，明顯高于肝硬化2497.1(117.2～3491.3)pg/ml 和慢性肝炎組1987.6(89.69～2987.3)pg/ml。結(jié)論： HCV感染者血清中IL-35水平明顯升高，提示IL-35在HCV持續(xù)感染的免疫致病機制中起著一定作用，為臨床診斷和治療HCV感染提供了一種思路。

KEW WORDS Hepacivirus Interleukin -35/analysis Virus infections/physiopathology

慢性丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染發(fā)病機制和轉(zhuǎn)歸涉及感染、遺傳、免疫等多個因素[1]。調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)能夠下調(diào)機體天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，和HCV的慢性感染密切相關(guān)，它能抑制自身抗原和外來抗原引起的免疫應(yīng)答，對抗感染免疫、抗腫瘤免疫反應(yīng)均具有明顯的抑制作用[2]。白細胞介素35(IL-35)的發(fā)現(xiàn)給免疫學(xué)在急慢性病毒感染發(fā)病機制及疾病預(yù)后帶來新的指導(dǎo)意義，這種細胞因子是由Collison和Workman等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的，具有強大的免疫抑制作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)IL-35具有調(diào)節(jié)Treg細胞分化的作用，在自身免疫性疾病的研究中越來越多，其能夠抑制Th17細胞亞群的分化和增殖，同時對Th17細胞分泌的細胞因子產(chǎn)生抑制作用，對自身免疫性疾病過度的免疫反應(yīng)具有抑制作用[3]。慢性HCV感染疾病進程中，不僅有Treg細胞的調(diào)節(jié)作用，Th17細胞也參與了疾病的進展和臨床結(jié)局，IL-35作為這兩種細胞的負性調(diào)節(jié)因子，目前的研究甚少，尤其是在慢性HCV感染的疾病進程中的作用。本文對HCV 感染者中慢性肝炎、丙型肝炎肝硬化和丙肝肝癌血清中 IL-35 表達水平進行分析，旨在探討 IL-35 在 HCV 持續(xù)感染中的作用。

資料與方法

1 一般資料 選擇2012年5月至2014年6月在我院就診的慢性HCV 感染者263例，其中，男93例，女170例，平均年齡40.83±11.09歲。按照2000年病毒性肝炎防治方案的臨床分類和診斷標準[4]和2001年全國肝癌學(xué)術(shù)會議通過的診斷標準，慢性丙型肝炎127例，HCV 相關(guān)肝硬化71例，HCV相關(guān)肝癌65例。肝硬化患者均無腹水，所有患者均排除合并有腎功能損害者以及合并其它慢性肝臟疾病(甲型、乙型、戊型病毒性肝炎，藥物性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎，Wilson's病)和可引起高代謝的疾病(包括糖尿病, 獲得性免疫缺陷綜合征,甲狀腺功能亢進)，均未進行干擾素抗病毒和免疫調(diào)節(jié)治療。同時選擇正常健康人117例作為對照，其中，男43例, 女74例，平均年齡39.78±1.19歲。研究對象均為中國陜西籍或長期居住在陜西地區(qū)的漢族人，且均為隨機選擇，無血緣關(guān)系，兩組在年齡、性別方面無差異，具有可比性。

2 實驗方法

2.1 標本的收集：入組患者清晨空腹無菌抽取靜脈血分裝2管，一管約2ml，用EDTA抗凝劑的試管收集，置于-30℃保存。另一管約3～5ml，用不加任何試劑的普通干燥管收集，然后離心10min(1000～2000轉(zhuǎn)/min)，提取上層血清分裝到干凈的EP管中，置于-30℃冰箱中保存，備用。

2.2 IL-35 濃度的測定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法。用抗人單抗IL-35包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-35與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人IL-35，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，IL-35濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中IL-35濃度。每孔各加入標準品或待測樣品100μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60min。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液100μl。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60min。再次洗板，每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30min。第三次洗板，每孔加入底物工作液100μl，置37 ℃暗處反應(yīng)15min。每孔加入100μl終止液混勻，30min內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。以標準品為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線，根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)IL-35含量。ELISA試劑盒為美國Cusabio公司生產(chǎn)。

2.3 肝功能檢查：肝功能ALT、AST、TBIL、ALB均采用全自動生化儀完成，HCV抗體由免疫實驗室采用ELISA的方法進行測定，HCV RNA檢測采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)( Realtime-PCR) 技術(shù)由基因診斷室實驗室完成。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：選擇SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，研究人群群體的代表性，采用卡方檢驗和t檢驗進行比較；不同組間的細胞因子IL-35的比較，進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的兩組間的比較采用t多組間的比較采用方差分析，進一步的兩兩比較采用LSD、SNK方法檢驗。P< 0.05為統(tǒng)計學(xué)有差異。

結(jié) 果

1 慢性HCV感染者和健康對照血清IL-35水平比較：慢性HCV感染者血清IL-35水平2972.63(89.69～4129.21) pg/ml明顯高于健康對照組979.12(63.27～2341.12) pg/ml，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2 慢性HCV感染不同臨床診斷的血清IL-35水平比較：慢性HCV感染者中，127例慢性肝炎男性42例，女性85例，平均年齡39.21±10.12歲；71例HCV相關(guān)肝硬化男性21例，女性50例，平均年齡43.21±13.65歲；65例HCV相關(guān)肝癌男性28例，女性37例，平均年齡44.59±11.22歲，三組比較性別無差異(P﹥0.05)。因疾病進程的原因，肝癌患者多數(shù)比肝硬化和慢性肝炎發(fā)生晚，在年齡方面差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。HCV相關(guān)肝癌血清IL-35水平3926.1(297.2～4129.1) pg/ml明顯高于肝硬化2497.1(117.2～3491.3) pg/ml和慢性肝炎1987.6(89.69～2987.3) pg/ml，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見附表。

附表 慢性HCV感染不同臨床診斷 的血清IL-35水平比較

討 論

由于疾病診斷技術(shù)和診療水平的提高，慢性HCV感染的發(fā)病率逐年升高，感染后不同免疫狀態(tài)下，會出現(xiàn)不同的臨床癥狀和表現(xiàn)，大多數(shù)都經(jīng)歷無癥狀期，慢性肝炎，肝硬化和肝細胞癌。慢性HCV感染過程中，有多種免疫細胞參與，細胞免疫和體液免疫均發(fā)揮著重要的作用，尤其是適應(yīng)性免疫，其是體內(nèi)被感染后，使機體產(chǎn)生抗感染能力。近年來，Treg細胞和Th17細胞在自身免疫性疾病和病毒感染性疾病中的研究越來越多，在慢性HCV感染中也有著重要作用，與疾病的進展和預(yù)后關(guān)系密切。在CD4+T細胞亞群中，Treg細胞是較為關(guān)鍵的細胞，其主要作用也是維持免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生，以及對慢性炎癥性疾病具有一定的調(diào)節(jié)作用。在慢性HBV感染、哮喘、炎癥性腸病改善炎癥反應(yīng)中的作用是不可估量的[4，5]。Treg/Th17細胞的平衡在慢性HCV感染中具體機制研究的還甚少，IL-35作為一種免疫抑制因子，不僅能夠促進Treg細胞的分化，還能夠抑制Th17細胞亞群的分化，在自身免疫疾病中過度免疫抑制中發(fā)揮著重要的作用[6]。然而IL-35在慢性HCV感染中的變化，尚未有具體的研究。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)IL-35在感染性疾病中的重要性，不論是急性感染還是慢性感染，其均發(fā)揮著不容忽視的作用，在急性感染階段，IL-35可誘導(dǎo)Th1細胞增殖來清除病原體，同時通過抑制Th17細胞分化來阻止過度的自身免疫反應(yīng)，還可擴增Treg細胞，在隨后的慢性感染階段發(fā)揮抑制效應(yīng)性T細胞作用，以阻止機體的免疫損傷，但Treg細胞在慢性丙型肝炎中的抑制作用很可能促進病毒的持續(xù)感染[7]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，不論是慢性HCV感染，還是自限性HCV感染，將中和抗IL-35抗體加入到Treg細胞和效應(yīng)細胞共培養(yǎng)體系中，能夠使Treg細胞介導(dǎo)的抑制效應(yīng)失效，使免疫抑制作用減弱[8]。這項發(fā)現(xiàn)也預(yù)示著中和抗體IL-35的治療作用，或者更進一步講能夠為臨床中解決HCV持續(xù)、慢性感染問題帶來希望。

這項研究對不同臨床類型和疾病進程中的慢性HCV感染者血清的IL-35水平進行了比較分析，研究結(jié)果顯示，慢性HCV感染者血清中IL-35水平2972.63(89.69～4129.21)pg/ml明顯高于健康對照組979.12(63.27～2341.12) pg/ml，這也說明慢性HCV感染中IL-35的升高是免疫抑制的一種表現(xiàn)，同時我們對不同臨床類型的慢性HCV感染者進行了分析，入組的不同臨床診斷的患者中，比較慢性肝炎、肝硬化和HCV相關(guān)肝癌的肝功能時發(fā)現(xiàn)，血清ALT、AST、TBIL比較無差異。在一定程度上講，ALT和AST受免疫系統(tǒng)調(diào)控，免疫系統(tǒng)中Th細胞間的平衡紊亂，同時也會伴隨ALT和AST的異常。為了減少ALT和AST變化的影響，我們選擇人群中基線水平相當?shù)穆訦CV感染者，發(fā)現(xiàn)HCV相關(guān)肝癌組的血清IL-35水平明顯高于肝硬化和慢性肝炎。腫瘤免疫與感染免疫的疊加，更加使得免疫抑制因子水平的升高，使得腫瘤逃逸，感染加劇。各項研究也支持我們的結(jié)果，IL-35在慢性HCV感染中發(fā)揮著作用，這種作用可能是通過其免疫抑制作用發(fā)揮的，其可以通過免疫調(diào)節(jié)機制，使得HCV與肝臟免疫細胞維持一種平衡，避免因為免疫反應(yīng)對肝臟細胞和組織造成的嚴重病理損害。一旦慢性HCV感染后，疾病免疫反應(yīng)發(fā)生變化，造成免疫紊亂和損害，IL-35又可以促進產(chǎn)生更多的免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)作用，這也是慢性HCV感染后肝細胞癌、肝硬化和慢性肝炎血清IL-35水平升高的一個原因。IL-35在自身免疫性疾病、感染性疾病以及腫瘤中的免疫調(diào)節(jié)作用，是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。然而，這些疾病往往是因為各種原因?qū)е抡５拿庖呦到y(tǒng)調(diào)控出現(xiàn)異常，IL-35在該類疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用也有著積極的意義，如果能夠研究或者發(fā)現(xiàn)IL-35在慢性HCV感染不同臨床分型和疾病進程中的免疫調(diào)節(jié)機制，就能夠為慢性HCV感染的治療帶來希望。

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(收稿：2014-12-01)

IL-35 expression levers in serum and its significance in patients with chronic hepatitis C virus infection

The Eighth Hosprtal of Xi’an(Xi’an 710061)

Yin Yi Jia Yuanhong Yao Xiangbo

Objective：Through the detection of chronic hepatitis C virus (HCV) infection interleukin in serum vitamin -35 (IL-35) expression levels of IL-35 inpersistent HCV infection, to explore the pathogenesis mechanism. Methods：With the method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to detect the serum IL-35 level in 263 patients with chronic hepatitis C patients and 117 healthy, and the different clinical diagnosed HCV patients and the level of IL-35 were compared and analyzed, and the analysis of the IL-35 and the ALT, AST, TBIL, the correlation between ALB and HCVRNA. Results ：The serum IL-35 levels of HCV infection increased significantly, higher than that of healthy controls group, where HCV related hepatocellular carcinoma IL-35 highest level in 3926.1 (297.2～4129.1) pg/ml was significantly higher than that in liver cirrhosis, 2497.1(117.2～3491.3) pg/ml and chronic hepatitis B group was 1987.6(89.69～2987.3) pg/ml . Conclusion ：The level of serum IL-35 is significantly increased in conclusion HCV infection, suggesting that IL-35 plays a role in the immune pathogenesis of HCV persistent infection, and provides a new idea for clinical diagnosis and treatment of the treatment of HCV infection.

丙型肝炎病毒 白細胞介素-35/分析 病毒感染/病理生理學(xué)

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.010

△西安市衛(wèi)生學(xué)校

▲西安市第八醫(yī)院肝病三科