細(xì)菌脂多糖作用下角膜上皮細(xì)胞Toll樣受體2、4動(dòng)態(tài)變化研究

西安市第一醫(yī)院 (西安 710002)

朱海峰 王 亮

細(xì)菌脂多糖作用下角膜上皮細(xì)胞Toll樣受體2、4動(dòng)態(tài)變化研究

西安市第一醫(yī)院 (西安 710002)

朱海峰 王 亮

目的：觀察角膜上皮細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖作用后不同時(shí)間Toll樣受體(TLR)2、4表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，初步明確TLR 在角膜細(xì)菌感染和保持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用。方法：培養(yǎng)永生化人角膜上皮細(xì)胞系，分別用10ng/ml和1μg/ml的細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激, 作用2h、4h、8h后檢測(cè)TLR2、4的表達(dá)，4h、8h、12h后檢測(cè)細(xì)胞分泌IL-6能力。結(jié)果：不同濃度LPS刺激后，細(xì)胞TLR2、4的mRNA表達(dá)水平在不同時(shí)點(diǎn)均明顯增高，但隨著刺激時(shí)間延長，細(xì)胞表面蛋白表達(dá)和IL-6的分泌水平則呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。結(jié)論：人角膜上皮細(xì)胞(HCE)能夠表達(dá)功能性的TLR2、4，并且在接受刺激后，TLR蛋白表達(dá)和炎癥因子分泌具有負(fù)反饋抑制。

感染性角膜病變是全球主要的致盲性眼病，角膜所處的解剖位置特殊，容易受到創(chuàng)傷和感染等各種外界因素的刺激。由于角膜自身沒有血管,角膜的天然免疫狀態(tài)對(duì)外來感染刺激物的反應(yīng)類型和程度直接決定了感染是否發(fā)生以及發(fā)生后轉(zhuǎn)歸。Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)是在天然免疫中發(fā)揮重要作用。已有部分研究證實(shí),角膜上皮細(xì)胞(CEC)和角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)功能性的TLRs,對(duì)病原微生物的識(shí)別和啟動(dòng)免疫的能力對(duì)眼組織免于遭受病原侵襲至關(guān)重要，同時(shí)TLR信號(hào)通路所誘發(fā)的角膜炎癥也嚴(yán)重?fù)p害角膜組織和視功能[1～3]。為此本研究觀察了不同濃度細(xì)菌脂多糖( Lipopolysaccharide, LPS )作用不同時(shí)間，角膜上皮細(xì)胞中TLR2、4表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，旨在揭示TLR 在角膜細(xì)菌感染和保持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用。

材料與方法

1 材 料 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Invitrogen公司。SYBR Green PCR試劑購自美國ABI公司。LPS購自美國Sigma公司兔抗人TLR2、4多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中杉金橋。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng): 參考Araki-Sasaki等[4]所述方法，SV40永生化的人角膜上皮細(xì)胞系(Human corneal epithelial cell line, HCEC)生長DMEM /F12培養(yǎng)液中，添加10%FBS、5 μg/ml胰島素、0.1 μg/ml霍亂毒素、5ng/ml人表皮生長因子、100U/ml 青霉素、100mg/ml鏈霉素，培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

2.2 LPS刺激: 將細(xì)胞傳代接種到6孔板中(每孔3×108)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為10ng/ml和1μg/ml的細(xì)菌LPS, 培養(yǎng)2h、4h、8h后檢測(cè)TLR2、4表達(dá)，4h、8h、12h后檢測(cè)細(xì)胞分泌IL-6能力。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)TLR2、4 mRNA表達(dá): LPS處理后的細(xì)胞，TRIzol提到總RNA，合成cDNA，設(shè)定反應(yīng)體系為25μl，取SYBR Green PCR Master Mix12.5μl，上下游引物(見附表)各20pmol，模板cDNA 50ng，加去離子水至25μl，應(yīng)用ABI7500 PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件均為50℃，2min，1個(gè)循環(huán)；95℃，10min，延伸95℃，15s，60℃，1min，40個(gè)循環(huán)。另取不同的模板濃度(0.2ng、2ng、20ng、200ng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，制定各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定各樣本PCR反應(yīng)液的熔解曲線。每樣本做3個(gè)復(fù)管。2-△△CT方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

附表 Real time PCR引物序列

2.4 流式細(xì)胞儀熒光染色檢測(cè)功能性TLR2、4 表達(dá): 收集LPS處理后的細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定，分別與兔抗人TLR2、4，多克隆抗體室溫geyc孵育1h，以BSA為陰性對(duì)照。FITC標(biāo)記二抗(山羊抗兔熒光二抗)2μl孵育30min(避光)，BSA緩沖液漂洗5min×2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC的熒光強(qiáng)度。

2.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞分泌IL-6能力: 將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為106/ml，96孔板中接種細(xì)胞100μl/孔，按預(yù)定時(shí)間加入LPS刺激后，按試劑盒說明操作，顯色結(jié)束后30min以內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取結(jié)果。

結(jié) 果

1 LPS對(duì)HCEC中TLR mRNA表達(dá)影響: qRT-PCR顯示與未處理組相比，HCEC接受不同濃度的LPS刺激后不同時(shí)點(diǎn)TLR2、4的mRNA水平均明顯升高(P<0.05)，高濃度刺激作用更為明顯(圖1)。

圖1 LPS對(duì)HCEC中TLR mRNA表達(dá)的影響(與未刺激組相比，*P<0.05)

2 LPS對(duì)HCEC表面功能性TLR 2、4表達(dá)的影響: 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示與未處理組相比，HCEC接受不同濃度的LPS刺激后不同時(shí)點(diǎn)TLR2、4熒光染色陽性細(xì)胞的比例呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(P<0.05)，高濃度LPS作用更為明顯(圖2)。

A:流式細(xì)胞儀分析示意圖，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，M2區(qū)表示熒光染色陽性細(xì)胞，B：流式細(xì)胞儀結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖2 LPS對(duì)HCEC表面功能性TLR 2、4表達(dá)的影響(與未刺激組相比，*P<0.05)

3 LPS對(duì)HCEC IL-6分泌的影響: 結(jié)果顯示與未處理組相比，HCEC接受不同濃度的LPS刺激后，上清液中IL-6的含量明顯增多，但4h后IL-6含量未明顯增加(圖3)。

(與未刺激組相比，*P<0.05)圖3 LPS對(duì)HCEC IL-6分泌的影響

討 論

TLRs廣泛存在于各種生物體內(nèi)，不僅在先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，而且還能夠調(diào)節(jié)獲得性免疫，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。TLRs作為模式識(shí)別受體，能夠特異性地識(shí)別病原微生物在進(jìn)化過程中保守的抗原分子，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答。TLR在眼表炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[5、6]。

從1997年第1個(gè)TLR即TLR4被發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TLR1～TLR13共13個(gè)成員[7]。目前的研究顯示角膜上皮細(xì)胞在mRNA水平表達(dá)TLR1～TLR10，但在蛋白水平僅表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9，并且是否表達(dá)為功能性受體還存在爭議[8、9]。由于永生化的HCE細(xì)胞在建系和傳代過程中保持了正常的TLR表達(dá)，被認(rèn)為是研究人角膜上皮TLR表達(dá)和功能的良好細(xì)胞系。為此，本研究SV40永生化的HCE細(xì)胞系為研究對(duì)象，結(jié)果顯示細(xì)胞表面可檢測(cè)到TLR2、4，并且LPS刺激后細(xì)胞能夠分泌IL-6，說明HCEC能夠表達(dá)功能性的TLR。宿主防御機(jī)制的重要部分就是其免疫識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別外來微生物并對(duì)其反應(yīng)。TLR2和TLR4是TLR家族中研究最早也是目前研究最清楚的成員之一，在LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起主要作用。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激后HCEC內(nèi)mRNA和胞膜上功能性受體的表達(dá)水平明顯增多，IL-6分泌增多，說明細(xì)胞在接受細(xì)菌產(chǎn)物后能夠啟動(dòng)炎癥反應(yīng)有效抵御感染。但值得注意的是，隨著刺激時(shí)間的延長，雖然TLRTLR2、4的mRNA表達(dá)仍然明顯高于未刺激細(xì)胞，但胞膜表面的功能性受體蛋白表達(dá)卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，甚至低于未刺激細(xì)胞。這與Erdinest[10]等的結(jié)果相似，說明HCE細(xì)胞TLR受體的表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。IL-6的分泌水平通常在刺激后4h達(dá)到高峰，但其半衰期僅有16min。本研究結(jié)果顯示培養(yǎng)體系中IL-6的含量4h以后隨著時(shí)間延長，未再明顯增加，甚至出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，表明LPS刺激引起的炎癥反應(yīng)得到了一定程度的抑制。

綜上所述，HCE能夠表達(dá)功能性的TLR2、4，并且在接受刺激后，TLR蛋白表達(dá)和炎癥因子分泌具有負(fù)反饋抑制，這可能是角膜上皮雖長期暴露在外界微生物及其產(chǎn)物的環(huán)境下，卻能保持免疫靜息環(huán)境的機(jī)制之一，細(xì)胞功能受損則可能TLR調(diào)節(jié)失效，進(jìn)而導(dǎo)致角膜不可控性炎癥，嚴(yán)重?fù)p害角膜組織和視功能。

[1] Lambiase A, Micera A, Sacchetti M,etal. Toll-like receptors in ocular surface diseases:Overview and new findings[J]. Clinical Science, 2011,120(10):441-50.

[2] Redfern RL, Mc Dermott AM. Toll-like receptors in ocular surface disease[J]. Experimental Eye Research,2010,90(6):679-87.

[3] Wong Y, Sethu C, Louafi F,etal. Lipopolysaccharide regulation of toll-like receptor-4 and matrix metalloprotease-9 in human primary corneal fibroblasts[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011,52(5):2796-803.

[4] Araki-Sasaki K, Ohashi Y, Sasabe T,etal. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science,1995,36(3):614-21.

[5] Pandey RK, Yu FS, Kumar A. Targeting toll-like receptor signaling as a novel approach to prevent ocular infectious diseases[J]. The Indian journal of medical research,2013,138(5):609-19.

[6] Kumar A, Yu FS. Toll-like receptors and corneal innate immunity[J]. Current Molecular Medicine, 2006,6(3):327-37.

[7] Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling[J]. Nature Reviews Immunology,2004,4(7):499-511.

[8] 高建魯, 吳欣怡. Toll樣受體在人眼角膜上皮和永生化人角膜上皮細(xì)胞系的表達(dá)及功能研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005,85(32):2269-73.

[9] 高建魯, 吳欣怡. 人角膜上皮細(xì)胞Toll樣受體介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[J]. 中華眼科雜志, 2006,42(7):628.

[10] Erdinest N, Aviel G, Moallem E,etal. Expression and activation of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 4 on human corneal epithelial and conjunctival fibroblasts[J]. Journal of Inflammation,2014,11(1):3.

(收稿：2014-10-13)

Dynamic changes in expression of Toll like receptor on cornea epithelial cells induced by lipopolysaccharide

The First Hospital of Xi’an (Xi’an 710002)

Zhu Haifeng Wang Liang

Objective:To evaluate the dynamic changes in expression of Toll like receptor on cornea epithelial cells induced by lipopolysaccharide and illustrate the effect of TLR in the bacterial infection and Immune homeostasis.Methods: Immortalized human corneal epithelial cell was treated by 10ng/ml and 1μg/ml lipopolysaccharide. The expression of TLR2 and 4 were detected with qRT-PCR from mRNA level and FACS from protein level, at 2, 4, and 8 hours after stimulation. The IL-6 level was examined by ELISA at 4, 8, and 12 hours after stimulation。Results: After stimulation with LPS, cells elicited an increase in the content of TLR2 and 4 specific mRNA at each time point. The cell surface expression of TLR and IL-6 secretion increased at early stage but decreased at late stage of LPS exposure.Conclusion: TLR 2 and 4 cell surface expression in HCE cell can recognize the stimulation of LPS, and their expression pattern constitutes a negative-feedback loop that is important in the bacterial infection and Immune homeostasis environment in the human cornea.

@ Toll like receptor Epitheliumcorneal Interleukin-6/metabolism Lipopolysaccharides/metabolism Imnunomodulation

@ Toll樣受體 上皮角膜 白細(xì)胞介素-6/代謝 脂多糖類/代謝 免疫調(diào)節(jié)

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.005